鼻病毒非结构蛋白2B 诱导细胞发生内质网应激

为探讨鼻病毒非结构蛋白2B诱导内质网应激和细胞凋亡的机制,本研究构建了鼻病毒非结构蛋白2B的真核表达载体p2B‐GFP ,通过转染BHK‐21细胞检测相关标志蛋白的变化情况。结果显示,非结构蛋白2B定位表达于BHK‐21细胞内质网,诱导内质网应激标志蛋白Grp78、CHOP的表达增加,并使活化转录因子6（ATF6）的转录活性增加,还诱导BHK‐21细胞发生核浓缩而凋亡,使凋亡标志蛋白PARP发生降解而减少。结果提示,鼻病毒非结构蛋白2B可诱导细胞发生内质网应激,并经该途径诱导细胞凋亡。     

人副流感病毒3型HN蛋白十一肽重复序列保守氨基酸突变分析

为确定人副流感病毒3型(Human parainfluenza virus type 3,hPIV3)病毒包膜表面血凝素神经氨酸酶(Hemagglutinin-neuraminidase,HN)糖蛋白茎部区十一肽重复序列中保守氨基酸中具有关键性作用的位点,进一步探讨HN蛋白茎部区在融合机制中的重要作用。结合定点突变和同源重组技术将HN蛋白茎部区十一肽重复序列中5个保守氨基酸位点(I102、P111、L114、S119、I125)突变为丙氨酸(Alanine,A),通过痘苗病毒-T7聚合酶系统在BHK-21细胞中表达突变蛋白,定性定量检测各突变体蛋白的促细胞融合活性、受体结合活性、神经氨酸酶活性和半融合活性。突变体蛋白I102A、P111A、L114A、S119A、I125A的促细胞融合活性均有不同程度下降,依次为野生型的6%、16%、14%、87%和4%,除S119A外其余4个突变型与野生型相比差别均具有统计学意义(P0.01);突变体蛋白I102A、P111A、L114A、S119A、I125A的受体结合活性也出现不同程度下降,依次分别为野生型的32.2%、77.4%、74.2%、83.9%和38.7%,其中I102A和I125A的受体结合活性与野生型相比差别具有统计学意义(P0.01);突变体蛋白I102A、P111A、L114A、S119A、I125A的神经氨酸酶活性分别为野生型的66.5%、73.1%、69.1%、76.1%和72.8%,与野生型相比差别无统计学意义(P0.05)。结果表明:茎部区十一肽重复序列对hPIV3HN蛋白的促细胞融合活性和受体结合活性具有重要意义。该区域氨基酸I102、P111、L114、I125具有关键作用,推测其能通过影响头部区受体结合活性或是与融合蛋白的相互作用等不同方式导致HN蛋白结构功能发生改变。     

副粘病毒HN蛋白颈部与F相互作用区功能的研究

副粘病毒(Paramyxovirus)包膜上镶嵌着两种糖蛋白血凝素-神经氨酸酶(Hemagglutinin-neuraminidase,HN)和融合蛋白(Fusion protein,F),两者的相互作用是决定病毒宿主范围、毒力和传播的关键。为探讨HN颈部与F相互作用区(Fusion interaction region,FIR)在膜融合机制中的作用,选取新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)与人副流感病毒3型(human parainfluenza virus type 3,hPIV3)为研究对象,通过片段置换及同源重组技术构建嵌合体C1、C2,进一步将NDV及hPIV3 HN的FIR内第51位丝氨酸(Serine,S)、第55位天冬氨酸(Aspartic acid,D)定点突变为丙氨酸(Alanine,A),获得突变体NDVS51A、NDVD55A、hPIV3 S51A、hPIV3 D55A,对嵌合体及突变体蛋白的细胞表面表达效率、受体识别活性、神经氨酸酶活性、促细胞融合活性及半融合活性进行检测。结果:各嵌合体C1、C2及突变体NDV S51A、NDV D55A、hPIV3 S51A、hPIV3 D55A的细胞表达效率、神经氨酸酶活性(Neuraminidase,NA)与野生型相比差异不显著(P0.05),但促细胞融合活性均有不同程度的降低(P0.05),C1、C2、NDV S51A、NDV D55A、hPIV3 S51A、hPIV3 D55A分别为野生型的7%、9%、27%、19%、17%和21%;C1、C2、NDV S51A、NDV D55A、hPIV3 S51A、hPIV3 D55A的受体识别活性分别为14.7%、22.3%、35.5%、28.8%、33.9%和40.2%,与野生型相比差异显著(P0.05)。结果表明:副粘病毒HN蛋白颈部与F相互作用区的突变及置换使HN蛋白的促细胞融合活性、受体识别活性降低,其中第51位丝氨酸(S51)及第55位天冬氨酸(D55)发挥重要作用。     

柯萨奇病毒B3蛋白酶2A干扰核因子κB p65的二聚体形成和核转移

为探讨柯萨奇病毒B3(CVB3)蛋白酶2A是否通过干扰核因子κB(NF-κB)的核定位而影响细胞因子表达,构建CVB3蛋白酶2A的表达载体pcDNA3.1-2A。将此表达载体与核转录因子NF-κB基因启动子荧光素酶报告基因载体pGL3-NF-κB promotor-Luc共转染细胞,经肿瘤坏死因子α(TNF-α)刺激,检测荧光素酶表达;通过免疫荧光和蛋白免疫印迹检测CVB3蛋白酶2A对NF-κB核定位和二聚体形成的影响。结果显示,CVB3蛋白酶2A可减少NF-κB二聚体形成,并干扰其核转移。本研究证实,CVB3蛋白酶2A可通过干扰NF-κB二聚体形成和核转移而影响细胞因子分泌。