农药鱼藤酮对表达α-突触核蛋白细胞的作用

本研究利用农药鱼藤酮作用于神经细胞 ,观察鱼藤酮对神经细胞的损伤作用以及线粒体功能障碍与α- synuclein积聚之间的关系。方法 :本实验选用人神经母细胞瘤细胞株SH-SY5Y ,实验组为α-synuclein GFP基因转染的细胞 ,鱼藤酮处理的转基因细胞和非转基因细胞 ,对照组为未处理的SH-SY5Y细胞。通过RT-PCR检测α-synuclein基因转染细胞的基因表达情况。荧光显微镜观察细胞内α-synuclein GFP表达产物绿色荧光蛋白。MTT法检测各组细胞活性。DCF检测细胞氧应激。HE染色、免疫组化检测α-synuclein在细胞中的状态。电镜观察细胞超微结构的改变。结果 :RT-PCR显示转基因细胞α-synuclein基因的表达。荧光显微镜观察显示细胞浆内可见绿色荧光蛋白 ,绿色荧光分布不均匀 ,可见蛋白积聚。MTT检测结果显示 ,与对照组相比 ,鱼藤酮处理的细胞增殖速度明显减小 (P <0. 01 )。鱼藤酮的浓度为 75nmol/ L、1 0 0nmol/ L时 ,未转基因与转基因的细胞活性相比较 ,前者的细胞活性低于后者 (P <0 .0 5 )。HE染色 ,鱼藤酮处理的转基因细胞胞浆减少、转基因细胞胞浆内也可见自噬体。胞浆内有嗜酸性包涵体样结构。免疫组化可见鱼藤酮处理高表达α-synuclein细胞明显变成梭形并有很长的突起。电镜显示鱼藤酮处理的细胞线粒体肿胀 ,嵴断裂 ,胞浆内形成自噬体。DCF检测转基因细胞内存在明显的氧化应激 ,并随鱼藤酮处理加重。结论 :农药鱼藤酮对多巴胺能神经细胞有明显的损伤作用 ,转基因细胞显示对较高浓度的鱼藤酮损伤有一定的耐受作用。α-synuclein可引起神经细胞的氧化应激并随鱼藤酮处理加重。提示环境因素可能与α-synuclein表达相互作用使多巴胺能神经元氧化应激进行性加重 ,这可能是引起PD的主要原因。     

6-羟多巴胺纹状体内注射制作大鼠帕金森病模型的研究

目的 为拓宽6-OHDA损毁多巴胺能神经元所制备大鼠帕金森病模型的应用范围,采用多位点纹状体内注入6-OHDA的途径来制备模型。方法 研究用SD大鼠,两个针道内四点定位注射,每点注射3μg／μ16-OHDA3μl。结果 术后两周出现缓慢旋转,4周旋转行为达到7转／分并保持稳定;形态学染色可见损毁1周后注射侧黑质酪氨酸羟化酶免疫组化阳性细胞减少20％,2周后减少38％,3～4周减少70％以上,6周后损伤趋缓。高效液相-电化学法活体检测纹状体内多巴胺的代谢产物3、4-二羟基苯乙酸(DOPAC)和高香草酸(HVA),发现注射侧和非注射侧相比含量分别下降98．33％和96．05％;组织匀浆检测损毁侧黑质多巴胺含量下降了73％以上,3、4-二羟基苯乙酸(DOPAC)含量下降60％。结论 纹状体内注射6-OHDA能够制备帕金森病大鼠模型。     

PINK1与α-synuclein相互作用结构域鉴定

目的: 确定PINK1与α-synuclein相互作用的结构域。方法: 将PINK1不同结构域质粒(pcDNA3.1-3xFlag-hPINK1^WT, pcDNA3.1-3xFlag-hPINK1(G309D),pcDNA3.1-3xFlag-hPINK1(ΔN35),pcDNA3.1-3xFlag-hPINK1(ΔC145),pcDNA3.1-3xFlag-hPINK1(156~509), pcDNA3.1-3xFlag-hPINK1(Δ156~581), pcDNA3.1-3xFlag-vector)分别和pCMV-Myc-α-synuclein质粒共转染人胚肾HEK293T细胞,通过免疫共沉淀(Co-IP)技术验证PINK1与α-synuclein相互作用的结构域;同时进行免疫细胞化学染色,利用激光扫描共聚焦显微镜观察两种蛋白的共定位关系。结果: Co-IP实验结果表明PINK1与α-synuclein相互作用的结构域为PINK1的激酶结构域。免疫细胞化学实验也证实α-synuclein只与含激酶结构域的PINK1蛋白在细胞中存在共定位关系。结论: PINK1与α-synuclein相互作用的结构域位于其激酶结构域。     

骨组织总RNA的提取技术

目的探讨Trizol试剂提取骨组织总RNA的技术方法。方法采用高速均质仪进行组织粉碎处理,用Tr-izol试剂提取RNA后,分3组进行RNA纯化处理,并通过紫外分光光度计、电泳、Real-time PCR等方法验证RNA的质量。结果用Tirzol试剂从经粉碎处理的骨组织中所提取的总RNA纯度差,只有再进行DNase1消化及有机溶剂再纯化后,才能保证所提RNA完整且纯净。结论从组织中提取的总RNA经DNase1消化及有机溶剂抽提,可提高RNA质量;另外实验证实用紫外分光光度法判断RNA的质量有许多局限性,利用琼脂糖电泳及Real-time PCR方法也能很简便的判断RNA质量。     

α-突触核蛋白N-端结构域参与线粒体功能的调控

目的：确定α-Synuclein蛋白与线粒体相互作用的功能结构域,并检测该结构域对线粒体功能的影响。方法：构建重组融合蛋白质粒pCMV-myc/α-Syn-WT、pCMV-myc/α-Syn-N和pCMV-myc/α-Syn-△N,转染人胚肾HEK293T细胞,通过免疫共沉淀明确α-Synuclein蛋白与线粒体相互作用的功能结构域。使用表达α-Synuclein蛋白的病毒上清感染小鼠多巴胺能神经细胞MN9D,通过免疫荧光、流式细胞术检测线粒体膜电位及Cytochrome c释放。结果：成功构建了pCMV-myc/α-Syn-WT、pCMV-myc/α-Syn-N和pCMV-myc/α-Syn-△N融合蛋白质粒,免疫共沉淀明确α-Synuclein N-端为其功能结构域,JC-1染色发现N-端使线粒体膜电位降低,流式细胞术证实N-端使Cytochrome c释放明显增加。结论：α-Synuclein N-端是其与线粒体相互作用的功能结构域,N-端降低线粒体功能。     

人AADC基因在cos-7细胞中的表达和活性检测

目的　研究人芳香族左旋氨基酸脱羧酶 (AADC)基因在多巴胺代谢过程中的作用。方法　从人胎儿黑质组织中提取总RNA ,以RT PCR法扩增AADCcDNA片段 ,克隆于 pGEM T载体中。测序正确后再构建真核表达载体 ,转染猴肾成纤维细胞COS 7,原位杂交检测AADC表达 ,加入L DOPA后 ,用高效液湘色谱测定转AADC细胞的多巴胺(DA)生成量 ,以了解转基因细胞AADC基因的功能活性。结果　RT PCR扩增出 144 2bp的cDNA片段与Genbank[NM 0 0 0 790 ]登录的序列相同 ,构建真核表达载体 pBK RSV AADC ,原位杂交证实其在COS 7表达阳性率为 70 % - 80 % ,在AADC活性作用下实验组的DA生成量是对照组的 4倍以上 (P <0 0 1)。结论　所克隆的AADC基因可在真核细胞中表达并具有生物活性。可望用于帕金森病的基因治疗。     

帕金森病相关蛋白PINK1和α-突触核蛋白相互作用研究

目的 利用蛋白质组学方法和激光扫描共聚焦显微镜来鉴定帕金森病相关蛋白PINK1和α-突触核蛋白（α-synuclein）之间的相互作用关系及两种蛋白在MN9D细胞中的分布。方法 将α-synuclein基因插入pGEX-4T-1载体,经DNA测序证明形成GST融合蛋白,经大肠杆菌BL-2l表达纯化后,与MN9D细胞裂解液共孵育,检测PINK1与α-synuclein蛋白间的相互作用。并应用MN9D细胞的内源性PINK1与α-synuclein进行免疫共沉淀实验,进一步验证两蛋白之间的相互作用。MN9D细胞经免疫细胞化学染色,利用激光扫描共聚焦显微镜观察两种蛋白的细胞内分布及共定位状态。结果 利用GST-α-synuclein融合蛋白捕获及免疫共沉淀技术,检测到特异的PINK1条带。激光扫描共聚焦显微镜检测到两者存在部分共定位。结论 PINK1和α-synuclein在体外和细胞内均可发生相互作用并在MN9D细胞中存在共定位关系。     

基因结构分析软件对实时定量PCR引物进行设计和筛选

目的：以人丝裂原活化蛋白激酶3(mitogen-activated protein kinase 3, ) 基因结构为例,利用不同生物相关软件分析、 设计和筛选合适的定量PCR 引物。方法：利用NCBI 的Gene 数据库查找人基因的参考序列、UniGene 数据库查找标准 参考序列;并用在线软件如Spidey, UCSC, Ensembl 等分析基因结构;利用Primer3,Oligo6,IDT 等软件进行引物设计;用MFOLD 程序分析基因二级结构后,选择引物可定位的外显子位置;利用电子PCR进行引物扩增特异性的检验;最后通过实验检验引物的 扩增效果。结果：从程序软件推荐的引物列表中筛选出一对能特异扩增人基因的引物。结论：基因结构分析软件有助于定 量PCR 引物的设计。     

三种人全血基因组DNA提取方法的比较

目的：比较改良酚一氯仿抽提法、盐析法、试剂盒法从人全血中提取基因组DNA的效果,以期建立一种快速、经济的提取高质量基因组DNA的方法。方法：分别用上述三种方法从人全血中提取基因组DNA,通过紫外分光光度计、琼脂糖凝胶电泳、聚合酶链式反应（PCR）、限制性内切酶酶切检测提取的基因组DNA的产量、纯度和质量。结果：改良酚一氯仿抽提法与试剂盒法提取的基因组DNA相比,DNA的产量有统计学差异,DNA的纯度无统计学差异,但试剂盒法提取的基因组DNA有较明显的降解现象：盐析法与改良酚．氯仿抽提法、试剂盒法相比,基因组DNA的产量和纯度都存在统计学差异,并且基因组DNA聚合酶链式反应（PCR）扩增的稳定性也明显劣于另外两种方法;三种方法提取基因组DNA均能进行限制性内切核酸消化。结论：改良酚一氯仿抽据取法是一种经济、快速、高效、稳定提取人全血基因组DNA的方法,适用于批量临床标本处理。     

实时荧光定量PCR 技术的原理及其应用研究进展

自从1983年Mullis发明聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)以来,PCR技术很快成为科研、临床诊断的热点技术。但是传统PCR技术在应用中一是不能准确定量,二是容易交叉污染,产生假阳性。直到近年来荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer,FRET)技术