三种不同方法固定的石蜡切片中RNA的分析

研究在 10 %中性福尔马林、丙酮、甲醇 氯仿 冰醋酸 3种方法固定的石蜡切片中提取RNA的质量和数量 .取 2 5 0g体重的Wistar大鼠的肾脏 ,分别采用 10 %中性福尔马林、丙酮、甲醇 氯仿 冰醋酸 3种方法固定 ,石蜡包埋 ,H E染色 ;采用RNA裂解液、TRIZOL试剂 2种方法提取切片RNA ,逆转录为cDNA ,采用普通PCR和SYBRGREEN 1定量PCR分析RNA质量和数量 .结果表明 ,3种固定方法都可保持组织良好的结构和形态 ;采用 2种提取方法 ,均可经RT PCR扩增出 180bp大鼠磷酸甘油醛脱氢酶 (G3PDH)、5 6 5bpβ肌动蛋白 (β actin)、10 0bp纤溶酶系活化剂抑制物 1(PAI 1) ;但采用RNA裂解液时 ,比TRIZOL试剂可提取更多的RNA .     

血管内皮细胞生长因子及其受体在IgA肾病患者肾组织中表达的研究

目的　检测 2 4例不同病理改变的IgA肾病患者肾组织中血管内皮细胞生长因子 (Vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)及其受体VEGF R2 (flk 1)和Ⅳ型胶原的表达 ,并将其表达水平与临床病理改变进行相关分析。方法　应用免疫组织化学SP法。结果　VEGF主要表达于肾小球脏层上皮细胞 ,flk 1主要表达于肾小球和间质血管内皮细胞。肾小球内VEGF和flk 1表达呈正相关 (P <0 0 5 ) ,两者在中度病变组肾小球内表达最多 ,重度病变组表达最少 (P <0 0 5 )。随病理改变程度加重 ,患者 2 4h尿蛋白定量、血压、血肌酐水平均明显增高 (P <0 0 5 )。肾小球内VEGF表达在轻、中度病变组与尿蛋白水平呈正相关 (P <0 0 5 ) ;在重度病变组则无相关性 ,与患者血压、血肌酐水平也无明显相关性 (P >0 0 5 )。肾小球内Ⅳ型胶原随病变加重表达增多 ,在重度病变组表达最多 (P <0 0 1) ;在轻、中度病变组肾小球内VEGF表达与Ⅳ型胶原的表达呈正相关 (P <0 0 5 )。各组肾小球内VEGF表达与肾小球微血管密度呈正相关 (P <0 0 1) ,重度病变组肾小球微血管密度减少 (P <0 0 5 )。结论　这些结果说明VEGF在IgA肾病的病理进展过程中发挥重要作用 ,可能涉及内皮细胞通透性增强、细胞外基质合成增多、血管生成障碍等多种机制     

TIMP-1转基因小鼠纯合子的建立及建系

采用遗传学育种方法 ,使外源基因整合位点随机的基质金属蛋白酶抑制剂 1(TIMP 1)转基因小鼠成为单一整合位点的纯合子转基因小鼠而建立TIMP 1转基因小鼠品系 .通过受精卵原核显微注射方法 ,获得带有人TIMP 1基因的Founder小鼠 .将转基因小鼠与正常小鼠交配 ,得到子代小鼠 .通过PCR及Southern印迹等方法 ,检测TIMP 1DNA在转基因小鼠体内的整合情况 ,阳性率达5 0 %后 ,进行近亲交配 .提取小鼠组织总RNA ,Northern印迹分析阳性小鼠各组织外源性TIMP 1mRNA表达情况 ,以正常NIH小鼠做对照 .获得了 6代小鼠共 4 2 4只 ,其中PCR阳性鼠 2 72只 ,Southern阳性鼠 2 2 6只 ,纯合子转基因小鼠 12 8只 ;F4代后阳性率达到 95 %以上 .转基因小鼠TIMP 1基因表达情况在肾脏的丰度明显高于肝脏和脾脏 (P <0 0 1) ,而肝和脾之间并没有显著差异 (P>0 0 5 ) .外源基因在转基因小鼠体内可以稳定遗传 ,并得到了整合有TIMP 1基因的纯合子转基因小鼠 ,且在阳性的转基因小鼠体内在肾脏中特异性表达 ,为以后开展TIMP 1的肾脏病理生理研究提供了有用的手段     

激光微切割与定量PCR技术分析肾脏病理切片RNA

采用激光微切割与定量PCR技术,分析使用不同提取方法从不同固定方法固定的病理切片中提取的RNA.用70%乙醇、丙酮、甲醇、4%多聚甲醛固定肾脏冰冻切片,使用激光微切割技术切取肾小球,用硫氰酸胍方法(guanidinethiocyanatemethods,GTC)和Trizol试剂方法提取RNA,使用Taqman定量PCR方法分析比较各组RNA的量;选取丙酮固定的石蜡切片,使用激光微切割技术切取肾小球,采用RNA裂解液提取RNA,使用Taqman定量PCR方法,比较石蜡切片和冰冻切片中RNA含量.结果显示:提取沉淀性固定剂如乙醇、丙酮、甲醇固定的冰冻切片的RNA时,2种提取方法和3种固定方法对RNA含量的影响都无明显差异;但在提取4%多聚甲醛固定冰冻切片时,使用Trizol提取RNA含量明显高于使用GTC方法,且其含量与沉淀性固定剂固定的切片RNA含量无明显差异.石蜡切片中经激光微切割肾小球的RNA含量与冰冻切片经激光微切割肾小球的RNA含量无明显差异.结果提示:切片的固定方法和RNA的提取方法是影响切片RNA提取量的主要原因.     

整合素相关激酶在糖尿病肾病的表达及其意义

目的探讨整合素相关激酶(Integrin-Linked Kinase,ILK)在糖尿病肾病患者肾组织中的表达及其意义.方法对3例正常肾组织,14例糖尿病肾病患者肾穿刺活检标本,应用免疫组织化学方法检测ILK和FN在肾组织的阳性表达强度,并作图像分析处理.结果在正常肾组织,ILK主要表达于肾小球脏层上皮细胞,系膜细胞和小管上皮细胞呈弱表达.在糖尿病肾病,ILK表达于肾小球脏层上皮细胞和系膜细胞,在萎缩变性的肾小管上皮细胞表达增强.在肾小球结节硬化时,ILK表达明显减少.此外,ILK和FN的表达量在糖尿病肾病早、中期成正相关(P<0.001),在糖尿病肾病晚期成负相关(P<0.05).结论 ILK在糖尿病肾病肾组织中表达量显著增加,并与FN的表达有一定的相关性,说明其可能通过促进细胞外基质FN等的积聚,在糖尿病肾小球硬化过程中发挥重要作用.     

巨噬细胞移动抑制因子在IgA肾病中的表达及意义

目的研究巨噬细胞移动抑制因子(MIF)在不同病变程度IgA肾病中的表达变化,探讨其对IgA肾病进展的影响。方法应用免疫组织化学双标记技术检测正常对照组及不同病变程度IgA肾病患者肾组织内MIF和人巨噬细胞标记抗原CD68的表达。肾组织病理改变采用常规病理学方法观察。详细收集每例患者肾活检时的24小时尿蛋白定量(TUPr)及内生肌酐清除率(CCr),并与免疫病理结果进行相关分析。结果对照组和IgA肾病轻度组仅有少量MIF和CD68表达。中、重度病变组较对照组及轻度病变组MIF和CD68的表达显著增加(P<0.05);MIF和CD68的表达之间具有显著相关性(P<0.05);肾组织内MIF、CD68及MIF /CD68 表达与TUPr及CCr具有显著相关性(P<0.05)。结论肾组织内MIF表达上调所导致的巨噬细胞浸润增加是IgA肾病进展的重要机制之一。