正交设计优化东亚砂藓DDRT-PCR反应体系

利用正交实验设计L25（5^6）对东亚砂藓（Racomitrium japonicum）DDRT—PCR反应体系的6因素（Mg^2＋、dNTP、锚定引物、随机引物、模板DNA、Taq酶）在5个水平上进行优化实验。结果筛选出各反应因素的最佳体系（20μL）为：Mg^2＋2．25mmol／L、dNTP0．4mmol／L、锚定引物1．0μmol／L、随机引物0．7μmol／L、模板DNA1．6μL、Taq酶2．5U。对东亚砂藓DDRT—PCR最佳反应体系进行梯度PCR引物退火温度筛选,得到的最佳退火温度为45．4℃。该优化体系的建立,为进一步进行东亚砂藓抗旱基因的筛选与克隆等一系列分子研究提供了重要参考依据。     

碱裂解法提取重组质粒DNA及PCR验证

目的:筛选获得高质量质粒,为进一步克隆、测序奠定基础.方法:采用常规的碱裂解法从大肠杆菌重组质粒中提取质粒DNA,核酸检测仪测定提取质粒DNA产量和纯度,并用前期DDRT-PCR时采用的引物进行PCR验证性实验,琼脂糖凝胶电泳检测,并对电泳图谱加以分析和鉴定.结果:利用常规的碱裂解法提取重组质粒,通过酚和氯仿的抽提,可以有效地去除蛋白质杂质,用含有Rnase抑制剂的无菌水溶解质粒提取效果最好,得到的质粒DNA无RNA污染,纯度比较高,OD260/OD280比值介于1.8～2.0之间,OD260/OD230比值大于2.0,经PCR反应验证后与预计相符.结论:通过该方法获得的重组质粒纯度和浓度都比较高,且PCR验证与预计相一致,可以满足后续分子生物学实验的要求.     

低温及贮藏年份对芍药种子生根及其生理特性的影响

以当年采收以及贮藏1年和2年的芍药种子为试验材料,对不同贮藏年份的芍药种子进行低温(-20℃、-40℃)及沙藏处理,同时测定处于不同生根阶段的芍药种子的生理生化指标,以明确芍药种子快速生根的途径,探讨芍药种子萌发生根的内在生理机制。结果表明:(1)单因素方差分析显示,贮藏年份、处理温度以及处理天数均对芍药首粒种子生根时间、生根指数、生根率有极显著的主效应,三因素单独对各生根指标都有极显著的影响,其中贮藏年份对种子生根的影响力最大。(2)在同一贮藏年份下,沙藏生根前进行-40℃低温处理30d对芍药种子生根效果最好,生根率最高(88.33%);不同贮藏年份的芍药种子在沙藏生根前进行同一低温处理后,贮藏1年的芍药种子生根效果优于当年采收和贮藏2年的芍药种子。(3)不同贮藏年份的芍药种子在生根过程中生理生化指标变化趋势相似,表现为含水量持续升高,可溶性糖含量先增加后减少,淀粉含量持续减少,可溶性蛋白含量先减少后增加;过氧化物酶活性先升高后降低,过氧化氢酶活性先降低后持续升高。研究发现,-40℃低温处理30d能够有效打破芍药种子下胚轴休眠,促进芍药种子生根,且采收后贮藏1年的芍药种子生根效果最好。     

砂藓丙二烯氧化环化酶基因RcAOC1的克隆及生物信息学分析

本研究采用PCR技术从砂藓(Racomitrium canescens)中克隆得到丙二烯氧化环化酶(allene oxide cyclase,AOC)基因,命名为RcAOC1。构建了RcAOC1过表达转基因烟草(Nicotiana tabacum)并对T0代转基因烟草进行了基因型鉴定。对RcAOC1进行了相关生物信息学分析,RcAOC1的cDNA开放阅读框长561 bp,编码含有186个氨基酸的多肽序列。RcAOC1蛋白理论等电点为5.16;不稳定系数为56.25,属于不稳定的蛋白质;脂肪指数为25.13,属于疏水性蛋白质。对蛋白的跨膜结构域进行分析,结果显示RcAOC1基因编码的蛋白不含跨膜区。预测RcAOC1蛋白不含有信号肽,属于非分泌型蛋白。砂藓中AOC1蛋白与其它植物中的AOC蛋白质序列具有较高的相似性,其中与小立碗藓AOC蛋白亲缘关系最近。本研究的结果为进一步研究RcAOC1基因的应用奠定了理论基础。     

东亚砂藓组织培养技术方法研究

以东亚砂藓（Racomitrium japonicum）配子体为外植体,比较了不同消毒液对消毒效果的影响,对接种消毒外植体的培养基进行了尝试性筛选,并研究了蔗糖浓度对东亚砂藓配子体生长的影响。结果显示,将东亚砂藓配子体用2％洗洁精溶液浸泡数分钟后,再用0．02％的升汞处理45-60S的消毒效果最佳;有机培养基是无菌外植体接种的最佳培养基;3％的蔗糖更有利于无菌外植体产生的原丝体团和幼嫩配子体的生长。