HIV-1 B’/C亚型Rev蛋白的表达、纯化与抗体制备

目的:为方便实验室工作中对HIV-1 B’/C亚型Rev蛋白的检测,制备相应的Rev蛋白及其抗体。方法:将我国HIV-1 B’/C亚型流行株的rev基因按大肠杆菌优势密码子进行改造后人工合成,在原核系统中与pET30a(+)载体中的His.Tag、Trx.Tag及S.Tag进行融合表达,目的蛋白经Ni2+金属螯合层析柱纯化后用于免疫家兔,制备多克隆抗体。结果与结论:合成基因在原核系统中融合表达得到相对分子质量约18×103的融合蛋白,目的蛋白的表达量约占菌体总蛋白量的36%;用纯化后的融合蛋白免疫家兔,制备了多克隆抗体,Western印迹及间接免疫荧光检测结果显示,获得的多克隆抗体与HIV-1 B’/C亚型的Rev蛋白能产生特异性反应,可用于检测HIV-1 B’/C亚型Rev蛋白的表达。     

HIV-1 tat基因改造及其蛋白表达、纯化与抗体制备

目的:为了方便实验室工作中HIV-1B'/C亚型及C亚型Tat蛋白的检测,制备了相应的Tat蛋白及其抗体。方法:将我国HIV-1B'/C亚型流行株tat基因的第1个外显子和HIV-1C亚型tat基因的第2个外显子融合在一起,将密码子替换为大肠杆菌的优势密码子,通过合成引物、PCR拼接的方法,获得目的基因序列;在原核系统中与pET32a 载体中的His·Tag、Trx·Tag及S·Tag进行融合表达;目的蛋白经Ni 金属螯合层析柱纯化后,用于免疫家兔,制备多克隆抗体。结果:PCR拼接获得306bp的目的基因序列;在原核系统中融合表达得到相对分子质量约31000的融合蛋白,占菌体总蛋白的21%。纯化后的融合蛋白免疫家兔,制备了多克隆抗体,Western印迹结果显示,获得的多克隆抗体与HIV-1B'/C亚型的Tat蛋白反应良好;间接免疫荧光结果表明,获得的多克隆抗体与HIV-1B'/C亚型和C亚型的Tat蛋白都能产生特异性反应。结论:制备的多克隆抗体能够使用间接免疫荧光方法检测HIV-1C亚型的Tat蛋白,使用Western印迹方法和间接免疫荧光方法都能检测HIV-1B'/C亚型的Tat蛋白。     

HIV-1 Gag多表位嵌合基因的构建及表达蛋白的抗体制备

旨在通过构建Gag的抗原多表位融合基因及在原核系统的高表达,为HIV诊断及可能的疫苗制备提供试验基础。选定HIV-1 Gag基因中3个片段包含较多抗原表位的区域,设计带有酶切位点的引物,用PCR的方法从HIV-1HXB2全基因扩增编码这3个片段的基因序列,通过质粒提取、酶切、测序方法鉴定基因片段的正确性,SDS-PAGE和Western blotting测定融合蛋白的表达,并免疫动物制备相应抗体。结果显示,构建的HIV-1 Gag多表位嵌合基因的原核表达质粒,酶切和测序结果表明基因序列正确,基因全长576bp。在大肠杆菌BL21(DE3)中高效表达的重组蛋白分子量为27kD,以包涵体的形式存在。纯化目的蛋白免疫家兔,制备多克隆抗体IgG。ELISA和免疫荧光方法检测显示制备的多克隆抗体能具有特异性反应。成功构建和高表达了HIV-1 Gag多表位融合蛋白,纯化蛋白制备的抗体与HIV-1Gag有特异性结合。为进一步研究HIV-1奠定了试验基础。     

人类博卡病毒(HBoV)非结构蛋白NS1基因的克隆、原核表达及多克隆抗体的制备

目的:克隆、表达、纯化人类博卡病毒(HBoV)非结构蛋白NS1,制备抗NS1多克隆抗体。方法:利用PCR扩增HBoV非结构蛋白NS1基因,将其克隆至pMAL-c2X表达载体上,重组质粒转化大肠杆菌DH10B,IPTG诱导表达。表达的融合蛋白经Amylose Resin亲和层析柱纯化后,免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体。用间接ELISA法检测抗体效价。结果:原核表达融合蛋白MBP-NS1,并获得了其多克隆抗体,抗体效价达到1∶32000。结论:在原核表达系统中表达、纯化了融合蛋白,制备抗NS1多克隆抗体,为进一步研究该病毒非结构蛋白基因的转录和翻译机制提供可靠的工具。     

重组丙型肝炎病毒核心蛋白的原核表达、纯化和抗体制备

本文旨在获得纯化丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白(HCV-C)及抗HCV-C多克隆抗体,为深入研究HCV-C与肝细胞相互作用的分子机制奠定基础。首先以HCV1b亚型HC-J4-91全基因组质粒为模板,聚合酶链反应(PCR)扩增HCV-C基因,构建重组质粒pQE31-HCV-C。融合蛋白经原核表达、纯化后,免疫BALB/c小鼠,制备抗HCV-C多克隆抗体。利用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测抗体效价,蛋白免疫印迹(Westernblot)和间接免疫荧光染色鉴定抗体特异性。结果显示,表达HCV-C的原核表达质粒pQE31-HCV-C构建正确,获得相对分子质量约22000的纯化融合蛋白。ELISA检测重组蛋白免疫小鼠的抗血清效价达1:12800。结果显示,自制的抗HCV-C多克隆抗体能特异性识别HCV-C。本研究获得了纯度较好、原核表达的HCV-C,并成功制备了抗HCV-C多克隆抗体,为深入研究HCV-C的致病机制提供了有实用价值的研究工具。     

弓形虫MIC2胞质尾段蛋白及其多克隆抗体的制备

目的:制备弓形虫微线体蛋白2胞质尾段(MIC2C)蛋白片段及其多克隆抗体。方法:以弓形虫cDNA文库为模板,PCR扩增135bp MIC2C基因片段,构建MIC2C/pGEX-4T-1原核表达系统;IPTG诱导表达GST-MIC2C融合蛋白;用纯化的融合蛋白加免疫佐剂背部皮内注射免疫新西兰兔,制备多克隆抗体,亲和层析纯化并分析抗体的效价。结果:构建了MIC2C原核表达系统,表达并纯化了GST-MIC2C融合蛋白,蛋白的浓度为3.07mg/ml;获得了抗该蛋白的兔源性抗血清,纯化后的多克隆抗体效价为1:16 000。结论:在体外制备并纯化了GST-MIC2C融合蛋白及其多克隆抗体,为后续弓形虫入侵机制的研究奠定了基础。     

酸弗林蛋白酶酸性氨基酸簇分选蛋白-1的原核表达、纯化及多克隆抗体制备

目的：原核表达和纯化PACS-1,并制备其多克隆抗体。方法：通过RT-PCR扩增出PACS-1的编码基因,测序正确后克隆入原核表达载体pGEX4T-1,转化大肠杆菌BL21（DE3）,以IPTG诱导PACS-1与GST融合蛋白的表达并经Glutathione Sepharose 4B纯化;经SDS-PAGE和Western blot鉴定,应用纯化的蛋白免疫家兔制备多克隆抗体,用ELISA测定抗体的效价。结果：表达和纯化了PACS-1,并获得了较高效价的抗血清。结论：获得纯化的PACS-1及其多克隆抗体,为进一步研究PACS-1的功能奠定了基础。     

跨膜逆向转运蛋白NHXFS1多克隆抗体的制备及应用

NHXFS1基因是通过DNA家族改组（DNA family shuffling）技术,以拟南芥、水稻和菊花的液泡膜Na＋/H＋逆向转运蛋白基因（NHX1）为亲本获得的活性显著增强的新基因。为制备该蛋白的多克隆抗体,对该蛋白进行跨膜结构分析,选取跨膜蛋白的C末端为靶标,并将其克隆到原核表达载体pET32a中,成功构建了原核融合蛋白pET32a-NHXFS1-抗原表达载体,转化大肠杆菌BL21（DE3）并诱导表达。通过镍柱亲和层析纯化该融合表达蛋白,获得了纯度约为80%的纯化蛋白,用于免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体。ELISA实验表明,该抗体的效价达到1：128 000,提取表达NHXFS1蛋白的酵母液泡经该多克隆抗体Western blot检测,证明该抗体具有较好的NHXFS1蛋白特异性。NHXFS1多克隆抗体的制备为进一步认识NHXFS1新蛋白结构与功能以及植物耐盐分子生物学的研究奠定了基础。     

SDHB蛋白的表达、纯化及多克隆抗体制备

SDHB(succinate dehydrogenage complex,subunit B)基因可能介导呼吸链生物功能和调控细胞生长.采用PCR技术扩增出SDHB基因,并将其连接到pGEX-4T-1原核表达载体中,经酶切及测序鉴定后,转化BL21细菌,并用IPTG诱导表达融合蛋白,谷胱甘肽琼脂糖珠亲和纯化,将纯化的融合蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,并用Western blot检测抗体.获得了SDHB原核表达重组融合蛋白及高效价的特异性兔抗SDHB多克隆抗体,为SDHB进一步的功能研究奠定了基础.     

H9N2型禽流感病毒核蛋白的原核表达及多克隆抗体制备

目的:利用大肠杆菌表达H9N2禽流感病毒(AIV)核蛋白(NP)与GST的融合蛋白并分离纯化,进行动物免疫制备多克隆抗体。方法:根据AIV NP基因序列设计引物,将已经获得的NP基因定向克隆到GST融合原核表达载体pGEX-KG并转化大肠杆菌,在IPTG诱导下获得高效表达。经谷胱甘肽层析柱分离纯化蛋白,制备抗原免疫家兔,得到pGEX-KG-NP多克隆抗体。结果:SDS-PAGE分析显示融合表达蛋白GST-NP相对分子质量约82 000,表达量约占菌体总蛋白的20%。Western-blot和ELISA检测结果表明,重组NP能与鸡抗AIV抗体发生明显的抗原抗体反应。自制的多克隆抗体能特异地与NP相互作用,可用于AIV病原诊断。结论:获得了NP基因的高效表达产物;制备了效价和特异性良好的抗重组NP多克隆抗体。经实验验证表达产物具有活性,多克隆抗体效价高,特异性强,为AIV病原诊断试剂的研发奠定了基础。     

拟南芥转录因子NF-YC的原核表达及多克隆抗体制备

采用PCR方法扩增NF-YC基因得到其全长cDNA序列,并将其克隆至原核表达载体pET-48b中,在大肠杆菌BL21中用IPTG诱导出分子量约为45 kD的融合蛋白,SDS-PAGE和Western blotting检测鉴定表达产物。利用亲和层析技术对融合蛋白进行纯化,纯化后的目的蛋白免疫新西兰兔制备多克隆抗体。间接ELISA检测抗体效价大于1 62 500,Western blotting结果显示,该抗体可特异性识别NF-YC蛋白。     

OS-9基因的融合表达、纯化及多克隆抗体制备

OS 9基因广泛表达于人体多种组织 ,该基因的表达产物可能与肿瘤的发生相关 .为获得可溶性表达的OS 9蛋白 ,制备多克隆抗体 ,深入了解OS 9基因的功能 ,将OS 9基因片段克隆入组氨酸标签融合的表达载体pET2 8a中 ,IPTG诱导 ,利用金属螯合亲和层析 (MCAC)进行纯化 ,薄层扫描及Bradford法检测纯化蛋白的纯度与含量 .免疫家兔制备多克隆抗体 ,利用间接ELISA法检测抗体效价 ,Western印迹检测抗体特异性 .经表达形式分析证明 ,融合蛋白大部分可溶 .薄层扫描分析纯度可达 90 %以上 ,Bradford法检测蛋白浓度约 0 1mg ml.抗血清效价可达 1∶32 0 0以上 ,Western印迹检测证明抗体特异性良好 .经诱导表达及纯化制备出可溶的纯度较高的OS 9蛋白产物 ,并获得高效价特异性良好的多克隆抗体     

兔抗肠道病毒71型截短VP1抗体的制备及鉴定

目的制备兔抗肠道病毒71型(EV71)截短VP1多克隆抗体,为EV71基础研究奠定基础。方法 RT-PCR扩增EV71VP1-N160基因(480 bp),以p GEX-6p-1为表达载体,构建重组表达质粒p GEX-6p-1-VP1-N160,转化大肠埃希菌BL21(DE3),IPTG诱导表达GST-VP1-N160融合蛋白,并对其进行纯化。以纯化的GST-VP1-N160融合蛋白作为免疫原,经背部皮下免疫新西兰大耳白兔,制备多克隆抗体,ELISA检测多克隆抗体效价,间接免疫荧光法和免疫印迹检测抗体特异性。结果经双酶切鉴定,表明重组表达质粒p GEX-6p-1-VP1-N160构建正确;GST-VP1-N160融合蛋白相对分子质量为35 000~55 000,主要为不可溶性包涵体形式,其在大肠杆菌中高效表达;纯化后目的蛋白纯度约为95%,蛋白质量浓度1.9 mg/m L;免疫家兔后,免疫血清效价可达1012,抗VP1-N160多克隆抗体可以识别EV71原核表达的重组蛋白及天然病毒抗原中的VP1,特异性好。结论成功制备了抗EV71截短VP1多克隆抗体。     

小鼠OAZ2基因的原核表达及抗体制备

目的:克隆小鼠鸟氨酸脱羧酶抗酶2(OAZ2)功能基因,原核表达、纯化OAZ2蛋白并制备抗OAZ2多克隆抗体.方法:IRT-PCR法从鼠黑色素瘤细胞总RNA中克隆OAZ2 cDNA后,通过重叠延伸PCR技术构建无需移码即可全长翻译的功能基因.将OAZ2功能基因克隆人原核表达载体pET15b并原核表达.表达的蛋白经Ni-NTA亲和层析纯化后,用SDS-PAGE和Western Blot分析鉴定.用纯化的OAZ2蛋白作为抗原免疫Bab/C小鼠以制备多克隆抗体,制备抗体用ELISA和Western Blot检测抗体滴度和特异性.结果:成功获得小鼠OAZ2 cDNA并构建出无需移码翻译的OAZ2功能基因.OAZ2功能基因在大肠杆菌BL21(DE3)中可诱导性高表达并能用Ni-NTA树脂高效纯化.用纯化蛋白免疫Bab/C小鼠制备的抗血清经ELISA检测有较高的多克隆抗体效价(＞1∶64000),经Western blot鉴定可与纯化的OAZ2蛋白质特异性结合.结论:建立了鼠OAZ2蛋白原核表达和纯化技术,制备出高效价和特异性抗OAZ2多克隆抗体,为进一步研究OAZ2基因的功能奠定了基础.     

小鼠Prune蛋白DHH结构域的原核表达及多克隆抗体的制备

[目的]表达、纯化小鼠Prune蛋白DHH结构域(m-Prune D),并制备多克隆抗体。[方法]生物信息学方法分析m-Prune D氨基酸序列;PCR扩增目的基因m-Prune D,克隆入原核表达载体p ET28a(+);IPTG诱导目的基因表达,SDS-PAGE和Western Blot鉴定蛋白表达,亲和层析法纯化蛋白;用纯化的重组m-Prune D免疫小鼠制备多克隆抗体;Western Blot检测多克隆抗体特异性。[结果]PCR成功扩增m-Prune D基因,双酶切及测序结果表明成功构建m-Prune D原核表达载体,SDS-PAGE和Western Blot鉴定表明成功表达约25 k Da的重组蛋白。纯化蛋白免疫小鼠后抗体滴度最高可达1∶25 600,所制备的多克隆抗体可特异性识别原核和真核细胞中DHH结构域蛋白。[结论]在E.coli中成功表达小鼠Prune蛋白DHH结构域,制备了多克隆抗体血清,可用于Prune蛋白生物学功能的进一步研究。     

中国旱獭β2m基因的克隆、原核表达及多克隆抗体的制备

目的克隆、原核表达中国旱獭β2m基因,并制备多克隆抗体。方法利用RT—PCR技术从中国旱獭脾细胞中扩增β2m基因,克隆至pET28a（＋）质粒,构建原核表达载体pET-28a（＋）-CWβ2m,再转化宿主菌Rosetta（DE3）pLacI诱导其表达。使用切胶回收纯化目的蛋白,将纯化蛋白免疫家兔制备多克隆抗体,并采用酶联免疫吸附实验检测抗体的灵敏度和特异性。结果克隆出的中国旱獭β2m基因,与GenBank已公布的土拨鼠的碱基序列一致;Western印迹结果显示克隆的β2m基因能在大肠埃希菌中高效表达,免疫家兔获得了高效价的多克隆抗体。结论成功克隆了中国旱獭β2m基因,在原核宿主中进行了高效表达,获得的多克隆抗体具有较高的效价。为人工制备MHC-Ⅰ类分子复合物,深入研究嗜肝病毒感染过程中特异性CTL应答和效应机制奠定了基础。     

家蚕GAPDH内参蛋白多克隆抗体的制备及其检测

制备家蚕GAPDH内参蛋白多克隆抗体,并对该抗体进行检测。利用PCR技术从家蚕中克隆GAPDH基因,构建其原核表达载体,转化大肠杆菌,诱导表达重组蛋白并纯化。纯化后的蛋白作为抗原免疫新西兰大白兔制备GAPDH多克隆抗体。用酶联免疫吸附法和Western blot检测抗体的效价和特异性。结果显示,成功构建GAPDH/p ET-28a原核表达载体,获得高纯度的GAPDH重组融合蛋白;经SDS-PAGE和抗His单抗检测,纯化后蛋白的分子量大小与预测的一致;以该蛋白为免疫抗原,采用4次免疫方式对新西兰大白兔进行免疫,获得GAPDH多克隆抗体血清。酶联免疫吸附检测结果表明,GAPDH抗体的效价为1:8000,并能与天然家蚕蛋白特异性结合。成功制备了家蚕内参蛋白GAPDH多克隆抗体,为深入研究家蚕中不同蛋白的生理功能和作用奠定了坚实的基础。     

大鼠丝氨酸或半胱氨酸蛋白酶抑制剂B2的表达、纯化及抗体制备

目的:原核表达、纯化大鼠丝氨酸或半胱氨酸蛋白酶抑制剂B2(SERPINB2),并制备其多克隆抗体.方法:设计扩增大鼠Serpinb2全长基因的特异引物,通过PCR扩增出该基因片段,测序正确后插入含GST基因的原核表达载体pGEX-KG中,以IPTG诱导表达,并经谷胱甘肽琼脂糖珠纯化融合蛋白;用纯化的蛋白免疫小鼠制备多克...     

人接头蛋白NRBP的表达、纯化及多克隆抗体制备

目的:制备接头蛋白NRBP的兔多克隆抗体,并检测该抗体的效价及特异性。方法:PCR方法以重组质粒PEF-NRBP为模板,获得NRBP全长及NRBP(1-99Aa)cDNA,构建到原核表达质粒pET-21a及pGEX-6P-1中。分别转入大肠杆菌BL21菌株,IPTG诱导表达后,纯化并鉴定表达产物将其免疫家兔,间接ELISA法及免疫印迹等方法鉴定抗体。结果:成功获得人NRBP的cDNA,构建得到相关的原核表达质粒,在大肠杆菌中可诱导性高表达,纯化后蛋白免疫家兔制备得到的抗血清经ELISA检测为阳性结果,4只免疫家兔的抗体效价约为1:5 200～1:40 000。Western印迹结果显示,该抗体可特异性的识别真核细胞外源性及内源性约60kDa的NRBP蛋白,并且具有较强免疫沉淀能力。结论:NRBP多克隆抗体具有很好的特异性和敏感性,该抗体的成功制备为进一步研究NRBP的功能提供了重要工具。     

拟南芥DREB 1A转录因子的原核表达和多克隆抗体制备

采用PCR技术,从质粒pCAMBIA 1301/DREB 1A中扩增拟南芥DREB 1A转录因子的编码序列,并将其插入原核表达载体pGEX-4T-1中诱导表达,获得分子量约50.4 kDa的融合蛋白,经融合蛋白纯化酶切后免疫家兔获得DREB 1A转录因子特异性的多克隆抗体,经酶联免疫吸附测定表明,所制备的多克隆抗体的稀释倍数为25 600时,显色仍清晰可见。