DREB1A 转录因子蛋白的原核表达

DREB1A是DREB转录因子的一员,它们都含有一段与DNA结合的保守区域,由58个氨基酸组成,称为EREBP/AP2结构域(EREBP/AP2 domain)。一个DREB转录因子可以调控多个与植物干旱、高盐及低温耐性有关的功能基因表达。从拟南芥中克隆了DREB1A转录因子基因,成功构建了DREB1A基因的原核表达载体,转化E.coliBL21(DE3),经1 mmol/L IPTG诱导表达获得了DREB1A蛋白,但以包涵体形式存在。为以后深入研究DREB转录因子与DRE顺式作用元件相互作用的具体机制奠定了基础。     

Nodal蛋白的表达、纯化及多克隆抗体制备

斑马鱼心脏发育模型中Nodal编码转录因子调节心脏的左右不对称发育,为了进一步研究Nodal信号途径在心脏发育中的调控作用和心脏疾病发生的分子机制,需要获得斑马鱼Nodal蛋白并制备其抗体.采用从斑马鱼心脏组织中提取RNA,通过反转录得到心脏组织各种表达基因的cDNA为模板,PCR扩增得到Nodal部分编码区序列,然后将其连接到pET-28a载体上获得原核表达.经酶切及测序鉴定后,转化Rosseta细菌,并用IPTG诱导表达融合蛋白,Ni-IDA凝胶柱亲和纯化,将纯化的融合蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,并用Western blotting检测抗体.获得了Nodal原核表达重组融合蛋白及高效价的特异性兔抗Nodal多克隆抗体,为Nodal功能的进一步研究奠定了基础.     

人类博卡病毒(HBoV)非结构蛋白NS1基因的克隆、原核表达及多克隆抗体的制备

目的:克隆、表达、纯化人类博卡病毒(HBoV)非结构蛋白NS1,制备抗NS1多克隆抗体。方法:利用PCR扩增HBoV非结构蛋白NS1基因,将其克隆至pMAL-c2X表达载体上,重组质粒转化大肠杆菌DH10B,IPTG诱导表达。表达的融合蛋白经Amylose Resin亲和层析柱纯化后,免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体。用间接ELISA法检测抗体效价。结果:原核表达融合蛋白MBP-NS1,并获得了其多克隆抗体,抗体效价达到1∶32000。结论:在原核表达系统中表达、纯化了融合蛋白,制备抗NS1多克隆抗体,为进一步研究该病毒非结构蛋白基因的转录和翻译机制提供可靠的工具。     

myh6蛋白的表达、纯化及多克隆抗体制备

斑马鱼心脏发育模型中,myh6编码是一种促进心室心肌细胞扩张的转录因子。为了进一步研究myh6在心脏发育和心脏疾病发生中的功能,需要获得斑马鱼myh6蛋白并制备其抗体。从斑马鱼心脏组织中提取总RNA,通过反转录得到心脏组织特异表达基因的cDNA,PCR扩增得到myh6部分编码区序列,然后将其连接到pGEx_4T载体上获得原核表达。经酶切及测序鉴定后,转化BL21细菌,并用IPTG诱导表达融合蛋白,谷胱甘肽琼脂糖珠亲和纯化,将纯化的融合蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,并用Western blotting检测抗体的特异性。结果显示,获得了myh6原核表达重组融合蛋白及高效价的特异性兔抗myh6多克隆抗体,为myh6功能的进一步研究提供了有力的工具。     

转录因子DREB1A和DREB2A调控机制的比较分析

DREB转录因子即干旱应答元件结合蛋白质,它能特异结合启动子中含有DRE／C1KT顺式元件,激活许多逆境诱导基因的表达,增强植物对逆境的忍耐力。从DREB1A和DREB2A转录因子结构、功能、调控表达的基因以及蛋白稳定性等方面进行比较分析,为植物抗逆转录因子研究及应用提供依据。     

转录因子DREBlA和DREB2A调控机制的比较分析

DREB转录因子即干旱应答元件结合蛋白质,它能特异结合启动子中含有DRE/CRT顺式元件,激活许多逆境诱导基因的表达,增强植物对逆境的忍耐力.从DREB1A和DREB2A转录因子结构、功能、调控表达的基因以及蛋白稳定性等方面进行比较分析,为植物抗逆转录因子研究及应用提供依据.     

斑马鱼心脏发育标记基因Wnt11的多克隆抗体制备

Wnt11为Wnt家族的成员,是参与Wnt信号途径调控的转录因子,对心脏的正常发育起着非常重要的作用.根据已报道的Wnt11基因序列,通过RT-PCR从斑马鱼心脏组织中得到Wnt11部分编码区序列,将其连接到pGEX-4T-1原核表达载体上.经酶切及测序鉴定后,质粒构建成功,将重组质粒(pGEX-4T-Wnt11)转化E.coli BL2l,通过IPTG诱导表达出融合蛋白,采用谷胱甘肽琼脂糖珠亲和纯化.将纯化的融合蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,并用Western Blot检测抗体的效价和特异性.结果显示,获得了Wnt11原核表达重组融合蛋白及高效价的特异性兔抗Wnt11多克隆抗体,为Wnt11功能的进一步研究奠定了基础.     

牙鲆甲状腺激素受体TRaA的原核表达和多克隆抗体的制备及应用

为研究牙鲆甲状腺激素受体TRαA在牙鲆变态发育过程中的调控作用,将TRαA基因克隆插入融合表达载体pET30a,并在大肠杆菌Escherichia coli DE3(BL21)中进行诱导表达。表达菌株经1mmol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导4h后,重组蛋白TRαA表达并形成包涵体。SDS-PAGE和Western blotting检测鉴定表达产物。包涵体经变性后在His-Bind树脂进行亲和层析纯化,柱上复性法对重组蛋白复性,获得纯度较高的目的蛋白,蛋白复性的效果良好。用纯化后的目的蛋白免疫新西兰家兔制备多克隆抗体。Dotblotting检测抗体效价达1:200000,检测证明抗体特异性良好。此外,通过染色质免疫沉淀技术鉴定了在活体细胞中多克隆抗体与TRαA的特异性结合,表明了甲状腺激素通过其受体在体内参与碱性磷酸酶(ALP)基因的转录调控。     

拟南芥转录因子DYT1的原核表达与多克隆抗体制备

以拟南芥雄性不育突变体ms157为材料,对其转录因子DYT1的原核表达进行了分析及多克隆抗体的制备.结果表明:构建的原核表达载体转化入BL21菌株后,经IPTG诱导,表达了分子量约为50 kD的重组蛋白.SDS-PAGE检测结果表明,该重组表达蛋白以可融性形式表达.用该蛋白作为抗原注射新西兰兔后,成功获取了多克隆抗体.Western blotting证实其具良好的免疫原性,ELISA结果表明融合蛋白的效价大于1:5 120.     

牙鲆甲状腺激素受体TRαA的原核表达和多克隆抗体的制备及应用

为研究牙鲆甲状腺激素受体TRαA在牙鲆变态发育过程中的调控作用,将TRαA基因克隆插入融合表达栽体pET30a,并在大肠杆菌Escherichia coli DE3(BL21)中进行诱导表达.表达菌株经1 mmol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导4 h后,重组蛋白TRaA表达并形成包涵体.SDS-PAGE和Western blotting检测鉴定表达产物.包涵体经变性后在His-Bind树脂进行亲和层析纯化,柱上复性法对重组蛋白复性,获得纯度较高的目的蛋白,蛋白复性的效果良好.用纯化后的目的蛋白免疫新西兰家兔制备多克隆抗体.Dot blotting检测抗体效价达1:200 000,检测证明抗体特异性良好.此外,通过染色质免疫沉淀技术鉴定了在活体细胞中多克隆抗体与TRαA的特异性结合.表明了甲状腺激素通过其受体在体内参与碱性磷酸酶(ALP)基因的转录调控.     

Determination of stoichiometry of radioiodination of proteins

A sensitive method for the detection of small quantities of hydrophobic antioxidant free radical scavengers such as butylatedhydroxytoluene (BHT) and butylatedhydroxyanisole (BHA) in aqueous samples is described. The procedure involves extraction of the hydrophobic free radical scavenger into an organic solvent phase, followed by the subsequent reaction of an aliquot of this extract with the stable cation radical tris(p-bromophenyl)amminium hexachloroantimonate (TBACA). In experiments with BHT and BHA, the loss of TBACA absorbance at 730 nm was found to be linearly proportional to the amount of antioxidant added, with quantities of BHT as small as 200 pmol being easily detectable. In aqueous suspensions of dimyristoylphosphatidylcholine vesicles, assays of the aqueous BHT concentration showed that BHT partitioned strongly into the membrane phase, achieving very high BHT/phospholipid ratios. For a given concentration of BHT, partitioning into the membrane phase was greater in large, multilamellar liposomes than in either small, single-walled vesicles or in purified rat brain synaptic vesicle membranes. Direct assay of BHT and BHA in phospholipid membranes, however, was complicated by a nonspecific interaction between TBACA and the phospholipid.