中国旱獭β2m基因的克隆、原核表达及多克隆抗体的制备

目的克隆、原核表达中国旱獭β2m基因,并制备多克隆抗体。方法利用RT—PCR技术从中国旱獭脾细胞中扩增β2m基因,克隆至pET28a（＋）质粒,构建原核表达载体pET-28a（＋）-CWβ2m,再转化宿主菌Rosetta（DE3）pLacI诱导其表达。使用切胶回收纯化目的蛋白,将纯化蛋白免疫家兔制备多克隆抗体,并采用酶联免疫吸附实验检测抗体的灵敏度和特异性。结果克隆出的中国旱獭β2m基因,与GenBank已公布的土拨鼠的碱基序列一致;Western印迹结果显示克隆的β2m基因能在大肠埃希菌中高效表达,免疫家兔获得了高效价的多克隆抗体。结论成功克隆了中国旱獭β2m基因,在原核宿主中进行了高效表达,获得的多克隆抗体具有较高的效价。为人工制备MHC-Ⅰ类分子复合物,深入研究嗜肝病毒感染过程中特异性CTL应答和效应机制奠定了基础。     

人PD1胞外须基因的克隆、蛋白表达及抗体制备

目的：研究人PD1的生物学活性,制备人PD1胞外段区域及其特异性抗体。方法：用PCR方法扩增编码人PD1胞外段的基因序列（hPD1ecr）,将其克隆到原核表达载体pET28a（＋）中,并转化至大肠杆菌BL21（DE3）中诱导表达,表达蛋白用SDS-PAGE和Western blot鉴定。纯化目的蛋白免疫日本大耳白兔,制备多克隆抗体。通过酶联免疫吸附实验（ELISA）,流式细胞术检测抗体滴度及其特异性。结果：原核表达载体pET28a（＋）-PD1ecr成功构建,并可在大肠杆菌BL21（DE3）中诱导表达,得到的PD1胞外区蛋白经SDS-PAGE和Western blot鉴定正确。用纯化蛋白免疫日本大耳白兔,制备的多克隆抗体具有较强免疫特异性。结论：得到纯化的人PD1胞外蛋白,制备的多克隆抗体能够检测自然状态下人PD1蛋白,为进一步研究PD1功能奠定了实验基础。     

重组人FOXL2基因的原核表达和纯化研究

目的通过pET32a（＋）原核表达载体,表达重组人叉头框蛋白L2（human forkhead box12,FOXL21）。并且进行纯化和鉴定。方法从正常人血液中提取基因组DNA,利用PCR扩增FOXL21目的基因片段,构建FOXL21原核表达重组质粒[pET32a（＋）-FOXL21]并转化E．coli的BL21（DE3）菌株,IPTG诱导重组蛋白表达,经HisTrap FF亲和层析柱纯化,再通过SDS—PAGE和Western印迹鉴定。结果成功克隆到大小为1131bp的人源FOXL21基因片段并准确插入表达载体pET32a（＋）,0．1mmol／LIPTG诱导转化菌8h可表达大量的FOXL21蛋白,并可经HisTrap FF柱亲和层析得到高度纯化。结论成功获得纯化的66kD重组人FOXL21蛋白,为后续进行FOXL21蛋白的功能研究奠定了基础。     

DNA损伤检查点蛋白调节子1片段的表达纯化及抗体制备

目的：原核表达、纯化DNA损伤检查点蛋白调节子1（MDC1）片段,并制备其多克隆抗体。方法：设计特异引物,通过RT-PCR扩增编码MDC1 N端194个氨基酸残基的基因片段,测序正确后插入含GST基因的原核表达载体pGEX-KG中,以IPTG诱导表达,并经谷胱甘肽琼脂糖珠纯化融合蛋白;用纯化的蛋白免疫小鼠制备多克隆抗体,用ELISA测定抗体的效价,Western印迹鉴定抗体的特异性。结果：原核表达并纯化了MDC1 N端片段,并获得了抗MDC1的多克隆抗体,抗体效价达到1∶12800,Western印迹显示该抗血清能特异识别原核及真核细胞表达的MDC1。结论：MDC1 N端片段能够诱导小鼠产生具有较高效价和特异性的多克隆抗体,为进一步研究MDC1在Fhit特异信号通路中的作用奠定了基础。     

人胱硫醚β合成酶原核表达纯化及鉴定

目的：构建人胱硫醚β合成酶（human cystathionineβ-synthase,hCBS）基因原核表达载体,在E.coli BL21（DE3）中表达,并进行纯化和酶活性检测。方法：以胰腺细胞cDNA文库为模板,采用聚合酶链式反应（PCR）扩增hCBS基因蛋白编码区的全序列,克隆入原核表达载体pET32a（＋）,构建重组质粒pET32a（＋）-hCBS。经限制性内切酶双酶切及DNA序列分析鉴定目的基因后与人CBS基因（基因bank号：BT007154.1）完全一致,转入E.coli BL21（DE3）中,由IPTG诱导表达融合蛋白。结果：经SDS-PAGE、Western blot分析,证明诱导表达的蛋白为重组人CBS（rhCBS）。再由Ni-NTA树脂亲和层析,并脱盐冷冻干燥后获得重组rhCBS（约19 mg/L培养物）,并测得其比活力约为57 kU/g。结论：成功地表达纯化出具有功能活性的重组蛋白rhCBS,为进一步研究该酶的相互作用蛋白以及其在生物学和临床科学的作用奠定了基础。     

人类博卡病毒(HBoV)非结构蛋白NS1基因的克隆、原核表达及多克隆抗体的制备

目的:克隆、表达、纯化人类博卡病毒(HBoV)非结构蛋白NS1,制备抗NS1多克隆抗体。方法:利用PCR扩增HBoV非结构蛋白NS1基因,将其克隆至pMAL-c2X表达载体上,重组质粒转化大肠杆菌DH10B,IPTG诱导表达。表达的融合蛋白经Amylose Resin亲和层析柱纯化后,免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体。用间接ELISA法检测抗体效价。结果:原核表达融合蛋白MBP-NS1,并获得了其多克隆抗体,抗体效价达到1∶32000。结论:在原核表达系统中表达、纯化了融合蛋白,制备抗NS1多克隆抗体,为进一步研究该病毒非结构蛋白基因的转录和翻译机制提供可靠的工具。     

猪FcγRIII的原核表达及多克隆抗体的制备

目的：构建猪FcγRIII 基因的原核表达载体,诱导表达重组蛋白,制备鼠抗猪 FcγRIII 抗血清。方法：从质粒pTG19-T-FcγRIII中用PCR方法克隆到编码完整猪FcγRIII蛋白分子的基因片段,将其插入到原核表达载体pET-32a中,构建了猪FcγRIII 原核表达载体pET-FcγRIII ,转化大肠杆菌BL21 (DE3) ,IPTG诱导蛋白表达,经尿素洗涤纯化后,以纯化后的融合蛋白FcγRIII-His 为抗原免疫小鼠,获得抗血清。Western blotting、ELISA 法鉴定获得的抗血清,ELISA 结果显示抗体效价为1∶16000,具有高度特异性,免疫印迹结果显示制备的多抗可以与重组猪FcγRIII蛋白特异性结合。结果：成功构建猪FcγRIII原核表达载体,纯化到融合蛋白FcγRIII-His,用纯化的融合蛋白免疫小鼠制备了多克隆抗体,Western blotting、ELISA 法证实多克隆抗体制备成功。结论：成功获得了猪 FcγRIII 多克隆抗体,为进一步研究猪FcγRIII 蛋白的功能奠定了基础。     

猪FcγRⅢ的原核表达及多克隆抗体的制备

目的:构建猪FcγRIII基因的原核表达载体,诱导表达重组蛋白,制备鼠抗猪FcγRIII抗血清。方法:从质粒pTG19-T-FcγRIII中用PCR方法克隆到编码完整猪FcγRIII蛋白分子的基因片段,将其插入到原核表达载体pET-32a中,构建了猪FcγRIII原核表达载体pET-FcγRIII,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导蛋白表达,经尿素洗涤纯化后,以纯化后的融合蛋白FcγRIII-His为抗原免疫小鼠,获得抗血清。Western blotting、ELISA法鉴定获得的抗血清,ELISA结果显示抗体效价为1∶16000,具有高度特异性,免疫印迹结果显示制备的多抗可以与重组猪FcγRIII蛋白特异性结合。结果:成功构建猪FcγRIII原核表达载体,纯化到融合蛋白FcγRIII-His,用纯化的融合蛋白免疫小鼠制备了多克隆抗体,Western blotting、ELISA法证实多克隆抗体制备成功。结论:成功获得了猪FcγRIII多克隆抗体,为进一步研究猪FcγRIII蛋白的功能奠定了基础。     

沙门菌毒力基因spvB的原核表达及其多克隆抗体的制备

目的:构建沙门菌毒力基因spvB的原核表达载体,诱导表达纯化SpvB蛋白并以其为抗原免疫小鼠,制备多克隆抗体。方法:利用生物信息学软件对SpvB进行分析,选取抗原性较高、易表达的氨基酸序列作为克隆序列,以携带spvB基因的鼠伤寒沙门菌为模板,PCR扩增目的片段后与原核表达载体pET28a(+)连接;将质粒pET28a-SpvB转化大肠埃希菌BL21(DE3)后诱导表达并纯化。目的蛋白免疫小鼠,制备抗SpvB多克隆抗体,Western blot检测抗体特异性。结果:成功构建spvB原核表达载体,经IPTG诱导结果显示,重组蛋白表达且主要存在于包涵体中,将纯化后的蛋白免疫小鼠Western blot检测血清中抗体与SpvB特异性结合。结论:获得具有免疫原性的SpvB蛋白及其多克隆抗体,为进一步研究该基因的功能奠定基础。     

Scytovirin在大肠杆菌中的可溶性表达

目的:获得Scytovirin(SVN)蛋白及其多克隆抗体.方法:按照NCBI上公布的SVN基因序列设计合成引物,合成SVN基因,构建pET32c-SVN原核表达重组质粒,经限制性酶切分析、DNA序列测定插入片段正确;将该重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导重组蛋白表达;用离子交换层析法及金属亲合层析法纯化蛋白,采用Tris-Tricine系统分析;以经过纯化的蛋白为抗原免疫白兔,制备SVN多克隆抗体.结果:对表达产物进行了分离纯化,SVN纯度达到91%;用纯化的样品制备了多克隆抗体,抗血清效价为1∶102 400.结论:SVN在大肠杆菌表达系统中获得了高效可溶表达,并制备了其多克隆抗体,为进一步深入研究SVN提供了材料.     

荷花液泡膜型Na^＋/H^＋逆向转运蛋白基因NnNHX1的克隆与特性分析

采用简并引物和RACE等技术从荷花中分离出液泡膜型Na＋/H＋逆向转运蛋白基因NHX1的全长cDNA序列,命名为NnNHX1。该基因全长2237bp,预测其编码一个由538个氨基酸组成的多肽,其N-端是一个由11个跨膜结构组成的疏水区域,C-端是一个亲水的尾巴。序列比对表明,NnNHX1与葡萄NHX1等的同源性较高,并且都具有高度保守的氨氯吡嗪咪结合位点序列LFFIYLLPPI。系统进化树表明NnNHX1与液胞膜型Na＋/H＋逆向转运蛋白关系较近,而与质膜型Na＋/H＋逆向转运蛋白关系较远。qRT-PCR结果显示NnNHX1基因在植株中属于组成型表达,但经NaCl诱导后,根中NnNHX1的表达量急剧增高后又迅速下降,而叶中的表达量却先缓慢增加后又剧烈下降。     

肺炎链球菌SpxA蛋白的原核表达、纯化及多克隆抗体的制备

目的 构建肺炎链球菌SpxA蛋白的原核表达系统,制备其多克隆抗体.方法 设计引物,利用PCR技术扩增肺炎链球菌D39菌株的spxA基因,并插入表达载体pET-28a（＋）内,测序鉴定.重组质粒转化至大肠埃希菌BL21（DE3）中,以IPTG诱导表达含6个组氨酸标签的SpxA重组蛋白,经Ni-NTA亲和层析柱纯化后,以其为抗原免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体.用ELISA及Western印迹方法分别检测多克隆抗体的效价及特异性.结果 从大肠埃希菌中诱导出高表达的SpxA重组蛋白,纯化后免疫小鼠获得抗血清,ELISA测定其效价可达1：2 560 000以上,Western印迹结果显示其能特异性地作用于肺炎链球菌SpxA.结论 成功构建了pET-28a（＋）-spxA原核表达质粒,获得了高纯度的目的 蛋白和高滴度、高特异性的多克隆抗体.     

Molecular and functional analyses of rice NHX-type Na<Superscript>+</Superscript>/H<Superscript>+</Superscript> antiporter genes

We previously cloned a vacuolar Na⁺/H⁺ antiporter gene (OsNHX1) from rice (Oryza sativa). Here we identified four additional NHX-type antiporter genes in rice (OsNHX2 through OsNHX5) and performed molecular and functional analyses of those genes. The exon–intron structure of the OsNHX genes and the phylogenetic tree of the OsNHX proteins suggest that the OsNHX proteins are categorized into two subgroups (OsNHX1 through OsNHX4 and OsNHX5). OsNHX1, OsNHX2, OsNHX3, and OsNHX5 can suppress the Na⁺, Li⁺, and hygromycin sensitivity of yeast nhx1 mutants and their sensitivity to a high K⁺ concentration. The expression of OsNHX1, OsNHX2, OsNHX3, and OsNHX5 is regulated differently in rice tissues and is increased by salt stress, hyperosmotic stress, and ABA. When we studied the expression of β-glucuronidase (GUS) driven by either the OsNHX1 or the OsNHX5 promoter, we observed activity in the stele, the emerging part of lateral roots, the vascular bundle, the water pore, and the basal part of seedling shoots with both promoters. In addition, each promoter had a unique expression pattern. OsNHX1 promoter–GUS activity only was localized to the guard cells and trichome, whereas OsNHX5 promoter–GUS activity only was localized to the root tip and pollen grains. Our results suggest that the members of this gene family play important roles in the compartmentalization into vacuoles of the Na⁺ and K⁺ that accumulate in the cytoplasm and that the differential regulation of antiporter gene expression in different rice tissues may be an important factor determining salt tolerance in rice.     

二色补血草液泡膜H^＋-ATP酶C亚基（LbVHA-C）基因克隆和表达分析

从二色补血草cDNA文库中分离出一个V-H^＋-ATP酶C亚基（LbVHA-C）基因全长cDNA序列。该基因全长为729bp。其中,开放读码框（ORF）为498bp,编码165个氨基酸,预测编码蛋白的分子量为16.6kDa,理论等电点为8.62。用实时定量RT-PCR方法进一步研究二色补血草在NaCl、NaHCO3和NaCO3胁迫下的不同时间内该基因表达模式的结果表明,NaCl强烈诱导二色补血草叶组织中LbVHA-C基因的表达,但其根部的表达变化不明显。NaHCO3胁迫下LbVHA-C基因在根部组织的表达受抑制。Na2CO3胁迫24h时的LbVHA-C基因在根和叶部组织中的表达都强烈受抑制,随后在根和叶组织的表达量逐步升高。     

小鼠mP24基因的原核表达及多抗制备

目的：本研究是为后续实验中深入研究小鼠mP24基因的功能及活性提供mP24多克隆抗体。方法：mP24是小鼠中新发现的新基因,通过构建了pET-28a（＋）/mP24原核表达质粒,转化入大肠杆菌BL21（DE3）中,IPTG诱导宿主细菌表达融合蛋白。经过SDS-PAGE分析,结果表明该蛋白能以可溶性蛋白形式存在。利用镍柱纯化融合蛋白,免疫新西兰兔,制备mP24多抗。结果：Western Blot结果显示,制备的抗小鼠mP24多克隆抗体具有较高的特异性。ELISA实验检测,该多抗对免疫抗原的效价高达1：9000,具有较高的效价。结论：本实验成功制备了mP24的多克隆抗体,为进一步开展mP24基因功能的研究奠定了基础。     

水稻NHX1基因启动子和C末端的调控功能研究

为了解水稻Na+/H+逆向转运蛋白(OsNHX1)在植物应答非生物胁迫中的分子调控机制,采用RT-PCR方法克隆OsNHX1基因上游2 000bp的启动子序列,并通过基因枪轰击瞬时转化洋葱表皮细胞,检测不同非生物胁迫下启动子的活性和表达模式;同时,分别克隆全长和C末端缺失的OsNHX1基因,通过花序浸染法转化拟南芥,研究OsNHX1基因及其C末端的功能。结果显示:OsNHX1启动子受逆境胁迫诱导,在盐、干旱、脱落酸胁迫处理下GUS表达活性明显升高;过表达OsNHX1的转基因拟南芥中,种子萌发率、根长、丙二醛含量和相对含水量的测定结果均显示其胁迫耐受性得到改善,但过表达OsNHX1C末端缺失基因对转基因植株的胁迫耐受性无明显影响。研究表明,Na+/H+逆向转运蛋白有助于提高植物耐盐性,且其C末端区域对该转运蛋白活性的发挥具有关键作用。     

沙门菌外膜蛋白D的原核表达及多克隆抗体制备

目的:在大肠杆菌中表达沙门菌外膜蛋白(OMP)D,纯化后制备兔抗OMPD抗体。方法:用PCR方法从鼠伤寒沙门菌中扩增出ompD基因,并插入融合表达载体pET-28a(+)的多克隆位点,构建重组表达质粒pET28a(+)-ompD;以重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),筛选阳性重组菌株,经IPTG诱导目的蛋白表达,在变性条件下对目的蛋白进行亲和层析纯化;以表达的OMPD蛋白免疫家兔,制备抗OMPD的多克隆抗体并进行鉴定。结果:扩增了ompD基因,测序证实正确后亚克隆于表达载体pET-28a(+)中,经PCR筛选和酶切鉴定获得阳性克隆,经诱导在大肠杆菌中表达出相对分子质量为40×103的目的蛋白并进行纯化;纯化的OMPD免疫家兔后,能有效地刺激特异性抗体的产生,抗血清的效价达到1∶10000以上,且具有良好的特异性。结论:构建ompD基因的原核表达载体,并在大肠杆菌中获得高效表达;制备出兔抗OMPD抗体,效价及特异性均良好,为进一步制备肠黏膜高亲和力疫苗奠定了基础。     

整株水平上Na^＋转运体与植物的抗盐性

植物可以利用不同的机制来维持Na^＋稳态,从而增强植物的抗盐性。这些机制包括：限制Na^＋的内流;增大Na^＋的外排;减少Na^＋向地上部分的运输;把进入地上部分的Na^＋分散到特殊部分（如老叶）或通过泌盐结构排出体外或通过韧皮部的再循环回到根部。本文简要介绍整株水平上Na^＋转运体与植物抗盐性的研究进展。     

Functional expression of mung bean Ca2+/H+ antiporter in yeast and its intracellular localization in the hypocotyl and tobacco cells.

The Ca2+-transport activity and intracellular localization of the translation product of cDNA for mung bean Ca2+/H+ antiporter (VCAX1) were examined. When the cDNA was expressed in Saccharomyces cerevisiae that lacked its own genes for vacuolar Ca2+-ATPase and the antiporter, VCAX1 complemented the active Ca2+ transporters, and the microsomal membranes from the transformant showed high activity of the Ca2+/H+ antiporter. Treatment of the vacuolar membranes with a cross-linking reagent resulted in a clear band of the dimer detected with antibody specific for VCAX1p. The antibody was also used for immunolocalization of the antiporter in fractions obtained by sucrose-density-gradient centrifugation of the microsomal fraction from mung bean. The immunostained band was detected in the vacuolar membrane fraction and the slightly heavy fractions that exhibited activity of the Golgi marker enzyme. A fusion protein of VCAX1p and green fluorescent protein was expressed in tobacco cells. The green fluorescence was clearly observed on the vacuolar membrane and, in some cases, in the small vesicles. The subcellular fractionation of transformed tobacco cells confirmed the vacuolar membrane localization of the fusion protein. These results confirm that VCAX1p functions in the vacuolar membrane as a Ca2+/H+ antiporter and also suggest that VCAX1p may exist in the Golgi apparatus.