肺炎球菌1型荚膜多糖多克隆抗体制备与夹心ELISA法建立及其在多糖浓度测定中的应用

目的：利用肺炎球菌1型全菌体制备多克隆抗体,并且利用该抗体建立肺炎1型荚膜多糖夹心酶联免疫吸附分析法（ Enzyme-linked immunosorbent assay ,ELISA）,用于检测发酵和纯化过程中的多糖浓度。方法用灭活的1型肺炎链球菌免疫家兔6周,获得高滴度的抗多糖血清,经过亲和层析纯化,获得高纯度的兔抗肺炎1型多糖抗体IgG。以纯化IgG作为包被抗体,加入多糖样品,再以生物素化的抗体作为检测抗体,建立夹心ELISA法检测肺炎1型多糖浓度。确定标准曲线的最佳线性范围,并对该方法进行特异性、准确性和精密度验证。结果兔免疫血清经过双向免疫扩散检测抗体滴度可达1∶32;该方法的线性检测范围为1．56～50 ng/mL;最低检测限为3．13 ng/mL。在标准品中混入其他型别多糖或培养基,回收率分别为102％和108％;该方法批内精密度和批间精密度分别为6．08％和7．01％。结论建立的夹心ELISA方法,其特异性、准确性和精密度均良好,可以特异地检测肺炎球菌1型多糖浓度。     

应用双抗体夹心ELISA法定量检测人源破伤风毒素单克隆抗体中的IgG含量

采用山羊抗人IgG作为包被抗体,辣根过氧化物酶标记的山羊抗人IgG作为标记抗体,建立一种双抗体夹心法用于定量检测人源破伤风毒素单克隆抗体的IgG含量。以纯化的IgG作标准,用平行线法测得亲和层析纯化的人源破伤风毒素单克隆抗体G2的含量为0．512μg／ml,与分光光度法测得的结果基本一致。因而样品检测采用纯化G2作参考标准,制作标准曲线,测定了已知样品和未知样品的抗体含量。结果表明本法重复性好,特异性强,可定量测定培养及纯化样品中人源单克隆抗体的含量。     

百日咳丝状血凝素酶联免疫检测法的建立

目的建立百日咳组分疫苗丝状血凝素(FHA)抗原含量监控的ELISA检测法。方法制备的多克隆抗血清,经辛酸硫酸铵法纯化抗体,用过碘酸钠氧化法辣根过氧化物酶标记,以棋盘滴定法确定最佳包被抗体及酶标抗体的浓度配伍,建立了双抗体夹心ELISA检测法。结果对双抗体夹心ELISA法的特异性、最佳线性范围、检测限度、精密度、准确度、测定限量、适用性的一系列验证试验表明,该方法与百日咳组分疫苗中PT和Prn无明显交叉反应,特异性较好。在0至20 ng/mL测量区间有最佳线性,相关系数大于0.99;经实验内12次及不同试验间3次测定16、8、4 ng/mL中的FHA含量,变异系数在0.2%～11.4%间,回收率在96.9%～114.5%间,精密度及准确度验证均符合常规质控要求,因此测定限量为4 ng/mL。结论该方法能有效检测出百日咳杆菌培养上清中的FHA含量,可用于百日咳组分疫苗生产过程的中间品质量控制。     

定量检测囊性纤维化跨膜传导调节因子BA-ELISA方法的建立与评价

目的:建立一种定量检测囊性纤维化跨膜传导调节因子(CFTR)的生物素-亲和素ELISA(BA-ELISA)方法并评价其可靠性。方法:优选设计CFTR三个表位的大肠杆菌表达抗原,免疫新西兰白兔获得CFTR多克隆抗体,用纯化后的抗体包被酶标板,并用生物素对其标记,从人精子提取CFTR作为抗原,用辣根过氧化物酶偶联的亲和素检测,优化两种抗体浓度及实验参数,建立可定量检测CFTR蛋白的双抗体夹心BA-ELISA方法;用临床精子标本评估所建立方法的重复性、特异性等。结果:CFTR包被抗体和生物素化CFTR抗体最适浓度分别为4μg/ml和10μg/ml,最佳封闭液为1%BSA-PBST,抗原与包被抗体最佳反应时间60 min,底物显色最佳时间15 min。批内、批间变异系数分别为2.16%~9.23%和2.29%~11.71%,包被的CFTR抗体与精子胞浆蛋白无交叉反应,最低检出下限为0.15 ng/ml,标准反应曲线具有良好的线性关系R2=0.962。结论:成功创建了定量检测CFTR蛋白的ELISA方法,具有特异性强、灵敏度高等特点。     

霍乱疫苗中残余霍乱毒素检测方法的建立及验证

采用间接酶联免疫法,即用神经节苷脂包被,加入待检样品,再加入兔抗霍乱毒素B亚单位抗体,用标准样品的吸光值(A值)对标准样品的浓度绘制4-参数拟合曲线,根据标准曲线计算出待测样品中的CT浓度。结果显示,在浓度范围(0.6～16)ng/ml之间,CT标准浓度和检测浓度成线性关系,r2=0.9986。精确度在浓度范围(0.6～16)ng/ml,CT的平均回收率在96.24%～114.44%之间。精密度:批内变异CV%≤12.98%,批间变异CV%≤18.48%。特异性CT浓度在10ng/ml时,平均回收率为102.6%;CT浓度在5ng/ml时,平均回收率为111.17%;CT浓度在2.5ng/ml时,平均回收率为123.83%。实验表明该方法可检测霍乱疫苗原液中CT的含量。     

双抗体夹心ELISA法测定残余汉逊酵母菌体蛋白含量的研究

目的 通过免疫白兔和小鼠获得抗汉逊酵母菌体全蛋白血清,建立测定残余宿主汉逊酵母菌体蛋白含量的双抗体夹心ELISA的方法.方法 由免疫动物得到抗血清,分别作为包被抗体和检测抗体,通过方阵滴定实验确定双抗体夹心ELISA最佳条件.结果 获得的兔、小鼠抗血清经间接ELISA检测效价均达到1:10000.作为包被抗体小鼠抗血清的最佳包被浓度为10 μg/ml,在30～500 ng/ml范围内测定呈直线关系,相关系数为0.9985.可用于测定基因工程产品中汉逊酵母菌体蛋白的残余量.     

人血清中Hib荚膜多糖抗体定量的ELISA方法建立及初步验证

目的比较两种不同活化方法制备的酪胺化Hib荚膜多糖(PRP-Ty)的特性,分别作为包被抗原建立测定人血清中Hib荚膜多糖特异抗体含量的ELISA方法。比较并确定包被抗原,对建立的ELISA方法进行初步验证。方法分别用CNBr和CDAP作为活化剂制备PRP-Ty,经Sepharose CL-4B层析分析相对分子质量分布范围,并确定适宜PRP-Ty抗原包被浓度的间接ELISA方法,以人Hib荚膜多糖IgG抗体定量标准品作为阳性标准,通过四参数非线性拟合计算人血清Hib荚膜多糖IgG抗体含量。结果 CNBr活化法制备的酪胺化Hib荚膜多糖(PRP-TyCNBr)较天然Hib荚膜多糖相对分子质量向小相对分子质量方向偏移,而CDAP活化法制备的酪胺化Hib荚膜多糖(PRP-TyC DAP)较天然Hib荚膜多糖相对分子质量分布无显著变化;两种PRP-Ty在0.65～2.00μg/mL的包被浓度范围内均有良好的包被活性,方法的灵敏度均达到0.02μg/mL IgG抗体检测水平。结论 PRP-TyC DAP作为包被物的ELISA测定方法可以更加真实可靠地反映人血清IgG抗体水平。     

肠道病毒71型灭活疫苗(Vero细胞)抗原含量检测方法的建立及应用

目的 建立肠道病毒71型(enterovirus type 71,EV-A71)灭活疫苗(Vero细胞)抗原含量检测方法并对其进行方法学验证及初步应用。方法 以抗EV-A71兔多克隆抗体为包被抗体，辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)标记的抗EV-A71鼠单克隆抗体为检测抗体，建立双抗体夹心ELISA并验证其线性范围、专属性、准确度、精密度及耐用性等。通过检测EV-A71疫苗原液及研发生产工艺各中间制品的EV-A71抗原含量评价该方法的适用性。结果 包被抗体与酶标抗体最佳稀释度分别为1∶5 000和1∶10 000。抗原为5～80 U/mL时，线性良好；与同为肠道病毒的其他抗原不存在交叉反应，专属性良好；对不同浓度抗原进行6次测定，其回收率在90%～100%,准确度良好；不同实验员对不同浓度抗原样品检测3次，CV均<11%,精密度良好；针对不同影响因素设计耐用性试验，回收率均在80%～120%,耐用性良好。该方法检测EV-A71疫苗原液和制备过程中的中间制品均具有良好的线性和平行性，表明该方法具有良好的适用性。结论 建立了EV-A71疫苗(Ve...     

人C1酯酶抑制剂抗原含量ELISA检测方法的建立、验证及应用

目的 建立C1酯酶抑制剂(C1 esterase inhibitor, C1-INH)抗原含量的双抗体夹心ELISA检测方法,验证后用于C1-INH纯化工艺摸索。方法 用羊抗人C1-INH抗体作为捕获抗体,用过氧化物酶(HRP)标记的羊抗人C1-INH抗体作为检测抗体,进行棋盘滴定初步确定捕获抗体的工作质量浓度,用西门子血浆标准品进行系列稀释作为标准品经过2轮实验来确定拟合曲线和线性范围及检测抗体的工作质量浓度,用血浆标准品标定电泳C1-INH标准品(电泳纯度>92%),分析与血浆标准品的平行性来选择本方法最终使用的标准品,最终建立了C1-INH抗原含量的双抗体夹心ELISA检测方法。对此方法进行线性、准确度、精密度、加样回收率、电泳标准品稳定性的验证。将验证后的方法用于C1-INH纯化工艺的摸索及产品质量分析,并与特定蛋白检测仪的结果进行比较。结果 捕获抗体质量浓度为400.000 ng/mL,检测抗体质量浓度为400.000 ng/mL,标准曲线采用四参数方程拟合,电泳标准品的质量浓度为0.895 mg/mL,血浆标准品作为本方法标准品;标准曲线的线性范围为1.560～100...     

猴B病毒抗体ELISA检测方法的建立和应用研究

目的　建立猴B病毒抗体ELISA检测方法。方法　采用方阵滴定法 ,比较不同血清稀释度、3种酶结合物、2种抗原对检测结果的影响 ,与国外同类参比实验室进行检测结果的比较 ,确定ELISA法的最佳实验条件。结果　HSV抗原包被浓度 10 μg ml,抗人IgG HRP为 1∶2 0 0 0时 ;或B病毒抗原包被浓度 10 μg ml,抗人IgG HRP为1∶4 0 0 0时 ,阴性血清和阳性血清的A值差距最大。与国外B病毒检测专业实验室的检测结果符合率分别为98 0 2 %和 97 5 2 %。结论　建立了猴B病毒抗体的ELISA检测方法 ,提高了检测方法的准确性。     

人巨细胞病毒IgG酶联免疫检测试剂盒的研制

为研制人巨细胞病毒 (HCMV)IgG酶联检测试剂盒 ,将HCMV接种人二倍体细胞 ,收获的病毒经纯化后用作包被抗原 ,辣根过氧化物酶 (HRP)标记羊抗人IgG为检测抗体 ,采用间接ELISA制备酶联免疫检测试剂盒并进行检定。该试剂盒操作简便、特异性强 ,稳定性、线性及精密性符合体外诊断试剂的要求。     

牛血清蛋白酶联免疫检测试剂盒的研制及验证

为研制酶联免疫试剂盒以检测病毒性疫苗中残余牛血清蛋白(BSP)含量,制备高效价高纯度的兔抗BSP多克隆抗体作为包被抗体和酶标抗体,建立了ELISA双抗体夹心法并组建试剂盒,通过标准剂量曲线可对样品中所含BSP、BSA及B-IgG进行定量,经验证该方法标准曲线线性范围内r≥0.98,对BSP的检测限量为3ng/ml;分别检测5、10、20ng/ml含量的BSP时,试验内(n=12)和试验间(n=3)测定的变异系数在3.71%到7.29%之间,回收率在93.4%~106.3%,未见该方法与人血清白蛋白、卵清蛋白以及疫苗复合保护剂之间有交叉反应。该法敏感度高,准确性、重复性和稳定性好,可用于疫苗牛血清残余蛋白的质量控制。     

Quantification of the secretory glycoproteins of the subcommissural organ by a sensitive sandwich ELISA with a polyclonal antibody and a set of monoclonal antibodies against the bovine Reissner’s fiber

The subcommissural organ (SCO) is an ependymal brain gland that releases glycoproteins into the ventricular cerebrospinal fluid where they condense to form the Reissner’s fiber (RF). We have developed a highly sensitive and specific two-antibody sandwich enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for the quantification of the bovine SCO secretory material. The assay was based on the use of the IgG fraction of a polyclonal antiserum against the bovine RF as capture antibody and a pool of three peroxidase-labeled monoclonal antibodies that recognize non-overlapping epitopes of the RF glycoproteins as detection antibody. The detection limit was 1 ng/ml and the working range extended from 1 to 4000 ng/ml. The calibration curve, generated with RF glycoproteins, showed two linear segments: one of low sensitivity, ranging from 1 to 125 ng/ml, and the other of high sensitivity between 125 and 4000 ng/ml. This assay was highly reproducible (mean intra- and interassay coefficient of variation 2.2% and 5.3%, respectively) and its detectability and sensitivity were higher than those of ELISAs using exclusively either polyclonal or monoclonal antibodies against RF glycoproteins. The assay succeeded in detecting and measuring secretory material in crude extracts of bovine SCO, culture medium supernatant of SCO explants and incubation medium of bovine RF; however, soluble secretory material was not detected in bovine cerebrospinal fluid.     

基于猪德尔塔冠状病毒重组核衣壳蛋白的ELISA抗体检测方法的建立与评价

【目的】猪德尔塔冠状病毒(Porcine deltacoronavirus,PDCoV)是近年来新发现的一种猪肠道冠状病毒,2014年首次暴发于美国,随后亚洲多个国家也相继报道,对养猪业构成了巨大威胁。以大肠杆菌表达纯化的PDCoV重组核衣壳(N)蛋白为包被抗原,建立检测PDCoV抗体的间接ELISA方法,为PDCoV的血清抗体检测和流行病学调查提供工具。【方法】以PDCoV CHN-HN-2014株的基因组RNA为模板,通过RT-PCR扩增PDCoV核衣壳蛋白(N)基因的全长cDNA,将其插入原核表达载体pET-30a中,构建原核表达质粒p ET30a-N,转化大肠杆菌Rosetta(DE3),经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside,IPTG)诱导表达,以纯化的重组N蛋白为包被抗原,建立PDCoV N-ELISA抗体检测方法,评估其特异性、敏感性、稳定性,并用于临床血清的检测。【结果】SDS-PAGE电泳检测证实表达的重组N蛋白主要以可溶性形式存在,Western blotting证实表达的重组蛋白具有反应活性。用纯化的重组蛋白建立的N-ELISA具有良好的特异性、敏感性、稳定性。与中和试验同时检测148份免疫猪血清和102份临床血清,两种方法的阳性符合率为88.99%,阴性符合率为92.90%,总符合率为91.20%。用建立的ELISA方法检测267份临床血清,PDCoV抗体阳性血清的比率为66.67%。【结论】建立的猪德尔塔冠状病毒N-ELISA抗体检测方法与中和试验的符合率高,可用于PDCoV血清抗体检测和流行病学调查。     

基于TbpA蛋白的副猪嗜血杆菌抗体间接酶联免疫吸附试验检测方法的建立及应用

【背景】副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,HPS)是猪革拉瑟氏病(Glasser’s Disease)的病原体,抗生素治疗和疫苗接种对于防控该病效果不明显,建立快速、准确的抗体检测方法尤为重要。【目的】利用表达纯化的HPS转铁结合蛋白A(TbpA)建立检测HPS抗体的间接酶联免疫吸附试验(ELISA)方法。【方法】PCR扩增HPS的tbpA基因并与原核表达载体pET-SUMO连接,通过PCR、双酶切及测序鉴定,将阳性重组质粒转入Escherichia coli Rosetta(DE3),IPTG诱导表达,SDS-PAGE和Western Blot鉴定产物。以纯化的TbpA蛋白作包被抗原,通过各种反应条件优化,建立检测HPS抗体的间接ELISA方法,并进行临床应用与评价。【结果】该方法的最佳条件:包被抗原浓度为5μg/mL,4℃过夜;5%脱脂奶粉于37℃封闭2 h;血清稀释度为1:1600,37℃孵育45 min;酶标二抗稀释度为1:5000,37℃作用30 min;显色时间为37℃ 5 min。该方法可特异性检测HPS抗体,阳性血清稀释至1:12800仍可检出,与其他猪病原阳性血清均无交叉反应,批内及批间变异系数均小于10%,与全菌体包被间接ELISA、商品化ELISA试剂盒及Western Blot比较,该方法总符合率分别为90.00%、86.67%和90.00%,其中阳性符合率分别为90.38%、88.46%和92.00%,阴性符合率分别为87.50%、75.00%和80.00%。该方法检测免疫抗体阳性率为80.00%,感染抗体阳性率为19.50%。【结论】基于TbpA蛋白建立的HPS抗体间接ELISA检测方法,具有良好的特异性、敏感性和重复性以及临床应用的可靠性,为HPS的免疫监测和流行病学调查提供了技术手段。     

Dot-ELISA检测莱姆病血清抗体的实验研究

经实验研究,建立了检测莱姆病血清IgG的Dot-ELISA方法。阻断试验表明,本法具有特异性。经对10例伯氏疏螺旋体人工感染兔血清和24例正常兔血清标本的检测证实,该法与常规ELISA法检测的符合率为100％。重复性试验表明其重复性良好。     

Improved ELISA test for determination of potency of Inactivated Poliovirus Vaccine (IPV).

An improved ELISA test for determination of potency of Inactivated Poliovirus Vaccine (IPV) is proposed. The method is based on the use of IgG purified from immune rabbit serum conjugated with biotin. Optimized and validated materials for the test can be stored for a long time in the form of ready-to-use kits. Optimization included selection of anti-poliovirus rabbit antibody batches with the best specificity to D-antigen as well as finding the most efficient parameters for all steps of ELISA protocol. The assay is based on direct ("sandwich") ELISA scheme, in which antigens are captured on ELISA plates coated with purified rabbit polyclonal D-antigen specific IgG raised against wild polioviruses of three serotypes. D-antigen specificity of the IgG was at least 10 times higher than to H-antigen (heat-inactivated virus). The presence of antigen was detected using biotin-conjugated IgG from the same source. Eight-point dose-response curves were obtained for each sample and the reference vaccine. The protocol ensured low background (less than 0.2 OD), linear response over the entire range of optical density measurements (up to 3.0 OD), and high precision of data (assay variability was about 3%). The quantitative results and the validity of the test were determined by two numerical approaches, linear regression and a new analysis procedure called the local interpolation method. For the first approach we also proposed a new method for testing of parallelism of regression lines. The ELISA protocol for all three types of poliovirus is based on standard off-the-shelf reagents, and is highly reproducible and reliable. An in-house Reference Reagent was formulated and calibrated against the International Reference for IPV.     

改良双抗体夹心酶联免疫法测定重组人活性蛋白C含量的研究

研究用ELISA法直接定量检测细胞培养液中的重组人活性蛋白C(rhAPC)。用改良双抗体夹心酶联免疫检测法进行定量分析。用棋盘滴定法对包被抗体、反应一抗和辣根过氧化物酶(HRP)标记二抗的适宜工作浓度进行了选择,并对实验条件进行优化,参考品标准曲线线性相关性较好。改良双抗体夹心酶联免疫检测法可用于直接定量分析细胞培养液中的rhAPC水平。     

Estimation of Chlorophyll in Tobacco Leaves by Direct Photometry

A simple portable instrument utilizing a cadmium sulphide light-dependentresistor in a bridge circuit, and its use in the in vivo estimationof total chlorophyll content of tobacco leaves, are described.The method has wide applicability in plant physiological andnutritional research, and in agriculture. The relationship betweeninstrument readout and chlorophyll content (calibration curve)was nearly parabolic and was determined largely by the light-scatteringproperties of the leaf. The effects of some environmental andplant parameters on this relationship and on the precision ofthe estimation were analysed. The importance of sampling procedurewas emphasized by a marked heterogeneity of chlorophyll distributionfound within leaves of all ages. A scattered-transmission spectrophotometerwas found to give the same type of calibration curve, and wasused to demonstrate that the ‘reference wavelength’correction used by previous authors has no effect on the shapeof the curve or the precision of the method.