大肠杆菌外膜蛋白酶T及其突变体的表达、复性及生物活性分析

外膜蛋白酶T(Outer-membrane protease T,OmpT)是定位于大肠杆菌外膜,具有高度底物特异性的蛋白水解酶。本文旨在建立克隆表达膜蛋白OmpT和体外复性的方法,考察其蛋白酶活性。首先以大肠杆菌基因组DNA为模板,PCR扩增ompT基因,连接至pET28a(pET-ompT),引入点突变Asp85Ala,构建表达质粒pET-ompT85。然后将两种重组质粒转化入BL21(DE3),均以包涵体形式大量表达。纯化后的蛋白经稀释法复性,并加入粗制脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)恢复蛋白酶活性。通过SDS-PAGE、鱼精蛋白水解试验及生长曲线观察表明,重组蛋白OmpT在体外能水解抗菌肽鱼精蛋白和兔肌肉肌酸激酶,而OmpT突变体则无上述功能。上述结果表明本文获得了具有蛋白水解酶功能的重组蛋白OmpT,该蛋白在体外可保护大肠杆菌抵抗鱼精蛋白的杀菌作用。     

基于TbpA蛋白的副猪嗜血杆菌抗体间接酶联免疫吸附试验检测方法的建立及应用

【背景】副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,HPS)是猪革拉瑟氏病(Glasser’s Disease)的病原体,抗生素治疗和疫苗接种对于防控该病效果不明显,建立快速、准确的抗体检测方法尤为重要。【目的】利用表达纯化的HPS转铁结合蛋白A(TbpA)建立检测HPS抗体的间接酶联免疫吸附试验(ELISA)方法。【方法】PCR扩增HPS的tbpA基因并与原核表达载体pET-SUMO连接,通过PCR、双酶切及测序鉴定,将阳性重组质粒转入Escherichia coli Rosetta(DE3),IPTG诱导表达,SDS-PAGE和Western Blot鉴定产物。以纯化的TbpA蛋白作包被抗原,通过各种反应条件优化,建立检测HPS抗体的间接ELISA方法,并进行临床应用与评价。【结果】该方法的最佳条件:包被抗原浓度为5μg/mL,4℃过夜;5%脱脂奶粉于37℃封闭2 h;血清稀释度为1:1600,37℃孵育45 min;酶标二抗稀释度为1:5000,37℃作用30 min;显色时间为37℃ 5 min。该方法可特异性检测HPS抗体,阳性血清稀释至1:12800仍可检出,与其他猪病原阳性血清均无交叉反应,批内及批间变异系数均小于10%,与全菌体包被间接ELISA、商品化ELISA试剂盒及Western Blot比较,该方法总符合率分别为90.00%、86.67%和90.00%,其中阳性符合率分别为90.38%、88.46%和92.00%,阴性符合率分别为87.50%、75.00%和80.00%。该方法检测免疫抗体阳性率为80.00%,感染抗体阳性率为19.50%。【结论】基于TbpA蛋白建立的HPS抗体间接ELISA检测方法,具有良好的特异性、敏感性和重复性以及临床应用的可靠性,为HPS的免疫监测和流行病学调查提供了技术手段。     

副猪嗜血杆菌安徽株血清型、基因型及耐药性

【背景】副猪嗜血杆菌(Haemophilusparasuis,HPS)是猪革拉瑟氏病(Gl?sser’sdisease)的病原体,由于长期使用抗生素产生的耐药性以及灭活疫苗缺乏交互免疫保护力,目前对该病无法形成有效防控。【目的】了解安徽地区副猪嗜血杆菌血清型、基因型及耐药性特征,为猪革拉瑟氏病的有效防控提供科学依据和技术支撑。【方法】针对2008–2017年安徽地区分离的44株HPS,利用PCR反应鉴定血清型,应用多位点序列分型(multilocus sequence typing,MLST)进行基因分型,通过微量稀释法测定最小抑菌浓度(minimalinhibitoryconcentration,MIC)。【结果】44株HPS共检测出6种血清型(1、4、5、7、13、14),血清型4型和13型为优势血清型,各占40.91%;9种ST型(ST241、ST267、ST268、ST269、ST270、ST271、ST272、ST273和ST274)中ST267和ST268为优势基因型,各占40.91%;对庆大霉素、青霉素的敏感率分别为100%和93.2%,86.4%的分离株呈现多重耐药,耐药谱型有33种,其中以甲氧苄啶/磺胺甲噁唑-四环素构成比最大,为42.4%。【结论】安徽地区HPS流行血清型和基因型呈现多元化,具有较高的遗传异质性,多重耐药现象严重,血清型、ST型与耐药性之间无明显相关性。     

酶法提取桑葚多糖的工艺研究

利用纤维素酶从桑葚中提取桑葚多糖,通过单因素实验和L9(34)正交实验研究酶用量、酶解时间、酶解温度对桑葚多糖提取率的影响。实验结果表明:纤维素酶能够显著提高桑椹多糖的提取率,并且提取温度是最重要的影响因素,其次是酶解时间,酶用量在此实验范围内对测定结果的影响最小,提取的最佳工艺条件为:酶解温度45℃,酶解时间150 min,酶用量4.0 mL。