大鼠肝tRNA^Ile基因在大肠杆菌中的表达及分离纯化

利用Ｔ７ＲＮＡ聚合酶／启动子表达系统在大肠杆菌ＪＭ１０９（ＤＥ３）中表达化学合成的大鼠肝ｔＲＮＡ＾Ｉｌｅ基因,经酚抽提,ＤＥＡＥ－５２离子交换柱层极及ＰＬＣ层析,分离纯化大鼠肝ｔＲＮＡ＾Ｉｌｅ,变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和Ｎｏｐｒｔｈｅｒｎ－ｂｌｏｔ鉴定表明,大鼠肝ｔＲＮＡ＾Ｉｌｅ基因成功地获得表达,氨酰化活性检测表明,纯化后,每１Ａ２６０（４０μｇ）的ｔＲＮＡ＾Ｉｌｅ可负载约６５０ｐｍｏｌ的Ｉｌｅ     

大鼠热休克蛋白70的融合表达及纯化鉴定

目的：在大肠杆菌中高效表达并纯化大鼠热休克蛋白（HSP）70与麦芽糖结合蛋白（MBP）的融合蛋白,以进一步研究细胞外HSfr70的生物学功能。方法：用RT-PCR方法扩增目的基因,并将其克隆到原核表达载体pMAL-c2X中,酶切鉴定并进行DNA测序;将该重组表达载体转化大肠杆菌B121,用IPTG在不同温度及时间下进行诱导表达,建立最佳诱导表达条件;采用Amylose树脂预装柱对目的蛋白进行亲和纯化,并对不同表达条件下的产物进行SDS-PAGE及Westernblot分析。结果：克隆出目的基因,构建了融合表达载体pMAL-c2X／hsp70;诱导表达后经SDS-PAGE检测表明获得了目的条带,并纯化出纯度较高的融合蛋白;免疫印迹鉴定表明其具有抗原活性。结论：在大肠杆菌中高效表达并纯化了融合蛋白MBP-HSP70,为进一步研究细胞外HSP70的生物学效应提供了有用的材料。     

人胰岛素原类似物(BKRA)基因的合成与表达

为了利用基因工程生产胰岛素,按照已知的人胰岛素Ａ、Ｂ链氨基酸序列和大肠杆菌偏爱的氨基酸密码子设计并合成了人胰岛素原类似物（ＢＫＲＡ）基因,其中以赖（Ｋ）－精（Ｒ）二肽编码区取代人胰岛素原Ｃ肽编码区．为了避免其编码蛋白在大肠杆菌中表达时被降解,通过人工接头将２个ＢＫＲＡ基因串联起来,接头部分氨基酸序列为Ａｒｇ－Ａｒｇ－Ａｓｎ－Ｓｅｒ．将串联的ＢＫＲＡ基因克隆到表达载体ｐＥＴ－２８ａ（＋）,实现了在大肠杆菌中的融合表达,表达产物以包含体形式存在,约占细菌总蛋白２４％．表达产物氨基末端具有六组氨酸肽段,以ＨｉＴｒａｐ凝胶进行亲和层析,一步纯化可达纯度９５％以上．放射免疫测定表明,纯化的融合蛋白具有胰岛素抗原活性．表明已构建成人胰岛素原类似物的高效表达菌株     

人蛋白质二硫键异构酶Cdna基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

从人胚胎肝组织中分离纯化出总RNA,在总RNA中提取mRNA,经逆转录得到cDNA第一条链,并以之为模板和相应寡聚脱氧核苷酸为引物．进行PCR合成人蛋白质二硫键异构酶(Proteim disulfide isomerase,PDI)cDNA基因,将所得cDNA克隆到质粒pUCl8上,转化大肠杆菌DH5a细胞,进行诱导表达筛选和活性筛选。将筛选的基因克隆到载体pBV220上,在大肠杆菌细胞中表达,产物以溶解形式在胞浆中表达。表达产物经硫酸铵分级沉淀和DEAE Sepharose Fast Flow柱层析分离,产物的纯度与活性分别为90％、1100u／g。     

谷氨酰t-RNA还原酶基因（hemA）的高效表达

枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）中的hemA基因编码谷氨酰tRNA还原酶,该酶是B. subtilis代谢途径中由谷氨酸到5-氨基乙酰丙酸（5-ALA）反应的限速酶。将B. subtilis的 hemA基因克隆到pET28a载体上,并在大肠杆菌（Escherichia coli）BL21（DE3）中诱导表达,SDS-PAGE电泳分析,表达的目的蛋白占总蛋白的20%。通过分离纯化得到谷氨酰tRNA还原酶。重组菌发酵液上清中5-ALA含量达40.2 mg/L,菌液呈红色,过筛试验和紫外分光光度检测验证显色物质为卟啉类,实验表明,表达的重组蛋白促进了5-ALA的合成和代谢。     

3种纯化重组禽流感病毒NS1抗原方法的比较

目的：摸索出最佳分离纯化和复性重组禽流感病毒NS1抗原的方法,得到高纯度的重组蛋白。方法：将重组质粒pET32a—NS1转染大肠杆菌BL21（DE3）后获得表达,分别以尿素变性、复性,Ni—NTA His．Bind Resin亲和,以及脱氧胆酸钠-N-十二烷基肌氨酸钠（DOC—SKL）洗涤溶解等3种纯化方法从表达产物包涵体中分离纯化NS1蛋白,并进行比较研究。结果：原核表达得到相对分子质量约45000的目的蛋白;3种纯化方法均能分离和纯化出NS1重组蛋白,其中尿素纯化的蛋白纯度为50％～60％,Ni—NTA His．Bind Resin亲和纯化的蛋白纯度为80％-90％,DOC-SKL纯化的蛋白纯度达95％以上;Western blot检测表明,复性后的纯化蛋白具有良好的生物学活性。结论：应用十二烷基肌氨酸钠洗涤纯化是最佳的纯化NS1蛋白的方法,所获得的蛋白可作为包被ELISA的抗原。     

大鼠肝tRNA~(Ile)基因的克隆与体外转录

采用PCR扩增出大鼠肝tRNAIle基因,构建了重组质粒pGWIW,并用T7RNA聚合酶／启动子系统对其进行了体外表达．经过对转录产物片段大小及运用Northernblot鉴定,证明获得了不含修饰核苷酸的大鼠肝tRNAIle生物学活性检测显示：合成基因体外转录产物氨基酰化活性是天然tRNA的40％,提示修饰核苷酸在哺乳动物Ile－tRNA合成酶的识别过程中起重要作用     

精氨酸脱亚氨酶的表达、纯化和活性研究

目的：建立精氨酸脱亚氨酶的高效表达菌种和纯化工艺路线。方法：人工合成编码支原体精氨酸脱亚氨酶（arginine deiminase, ADI）的基因,构建pBV220-ADI原核表达载体,转染大肠杆菌DH5α中并诱导表达目的蛋白,离子交换层析和分子筛层析法纯化目标蛋白。采用体外精氨酸降解试验测定纯化产物活性。结果：成功构建了原核表达载体pBV220-ADI,基因侧序正确。转化大肠杆菌DH5α后筛选到高水平表达目的蛋白的菌株,目标蛋白以包含体形式存在于胞浆内,表达水平超过全菌体蛋白的35%。采用盐酸胍溶解包含体、低温条件下稀释和透析的方法进行复性。顺次采用阳离子交换和凝胶过滤层析对复性液进行纯化,最终获得纯度达到95%的活性产物。活性测定表明,纯化的ADI比活性为80IU/mg。结论：成功构建了ADI的高效表达菌种,建立了目标物质的分离纯化方法。     

鲎血细胞中脂多糖结合蛋白TALF在大肠杆菌中的表达研究

TALF(Tachyleus antilipoposaccharide factor)对细菌内毒素（LPS）的核心部分有抑制作用。研究TALF cDNA基因在大肠杆菌中的表达,首先将TALF cDNA基因分别插入大肠杆菌表达载体pGEX-4T-2、pET22b、pET28a中,构建重组表达质粒,转化于大肠杆菌BL21(DE3)。结果表明克隆于pET22b、pET28a中的TALF cDNA基因没有表达,而融合了GST的TALF基因（GST-TALF）能够在大肠杆菌中表达,并形成包涵体。从1L培养基中可获得4mg纯度为91%的GST-TALF融合蛋白。经复性和纯化后的融合蛋白GST-TALF几乎检测不到抑菌活性及LPS中和活性,但该融合蛋白经凝血酶消化后表现出明显的体外抑菌活性及LPS中和活性。     

马肝醇脱氢酶基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

利用RT-PCR技术从马肝扩增HLADH-E和HLADH-S基因,通过基因工程方法构建表达质粒pLY115E和pLY115S,在大肠杆菌中表达,并利用Ni柱分离纯化。利用紫外检测辅酶NADH在340nm的吸光值,来考察表达产物转化环己醇的活性。试验结果证明马肝醇脱氢酶HLADH-E和HLADH-S基因均能在大肠杆菌中表达,并且可溶性表达产物都具有氧化环己醇的活性,为马肝醇脱氢酶的进一步研究开发奠定了基础。     

抗菌肽PekⅡ基因在大肠杆菌中的融合表达及初步纯化

目的：研究抗菌肽PekⅡ基因在大肠杆菌中的融合表达并初步纯化。方法：根据大肠杆菌密码子的偏好性,人工设计并合成2段核苷酸序列,退火获得PekⅡ基因;将此基因克隆到原核表达载体pGEX-4T-2中,构建成抗菌肽基因PekⅡ融合表达载体pGEX-PekⅡ,转化至大肠杆菌BL21中,用IPTG进行诱导。取超声破碎后的上清经Glutathione SepharoseTM4亲和层析得到纯化融合蛋白。结果：PCR和测序表明已获得正确PekⅡ编码基因,SDS-PAGE显示29kD处有特异性的蛋白条带出现,纯化得到的GST-PekⅡ经MALDI-TOFMS分析得出其相对分子质量为29553．03。结论：抗菌肽PekⅡ基因在大肠杆菌中的融合表达获得成功,初步纯化得到纯品。     

炭疽杆菌保护性抗原在大肠杆菌中的表达及其纯化

利用基因重组技术获取炭疽杆菌保护性抗原(PA)。将炭疽杆菌保护性抗原编码基因pag与pET载体连接构建重组质粒,转化大肠杆菌DE3株,诱导表达炭疽杆菌保护性抗原,并经亲和层析及凝胶过滤纯化此抗原。实验成功构建了表达炭疽杆菌保护性抗原的重组菌株,纯化后PA纯度达90%,且经检测纯化产物具有天然PA的生物学活性。同时表明从大肠杆菌中纯化PA较以往从炭疽杆菌中获取PA简便易行。     

人精氨酸酶在毕赤酵母的高效表达、纯化和活性研究

目的：人精氨酸酶（Arginase, Arg）的基因arg在毕赤酵母高效分泌表达,建立相应纯化工艺路线,研究重组人精氨酸酶的活性。方法：将人精氨酸酶基因arg按正确的阅读框架插入到毕赤酵母表达载体pPIC9α信号肽基因后,构建得到重组毕赤酵母表达质粒。转化毕赤酵母GS115筛选高表达菌株。结果：成功构建了酵母表达载体pPIC-Arg,转化毕赤酵母GS115后筛选到分泌表达目的蛋白Arg的菌株,目标蛋白可以分泌到培养基中。经过膜过滤和凝胶过滤层析对培养基上清进行纯化,即可获得纯度达到95%的活性产物。活性测定表明,纯化的Arg比活性为310 IU/mg。结论：成功构建了Arg的毕赤酵母高效表达菌种,建立了目标物质的分离纯化工艺。     

核酸去甲基酶AlkB在毕赤酵母中的表达纯化及在tRNA相关研究中的应用

[目的]核酸的甲基化修饰是一种常见的化学修饰形式,具有重要的生物学功能,却也在一定程度上给一些核酸研究过程带来了技术难度。tRNA上具有的大量甲基化修饰会阻碍逆转录进程,从而降低荧光定量PCR (real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)和高通量测序对其的检测效率。来自大肠杆菌(Escherichia coli)的AlkB蛋白是一种多功能的脱烷基化酶,可以去除DNA和RNA上多种甲基化为代表的修饰,有望解决以上问题。[方法]针对大肠杆菌来源的AlkB,分别尝试在大肠杆菌和毕赤酵母(Pichia pastoris)表达系统中进行诱导表达和纯化,对纯化获得的AlkB进行酶学性质测定。最后以tRNA_UAU^Ile等两种tRNA为代表,研究AlkB的处理对于荧光定量PCR法检测tRNA表达水平的影响。[结果]AlkB在大肠杆菌中表达时多以包涵体形式存在,但是在毕赤酵母中可以成功分泌表达。使用镍柱分离纯化后获得了纯度高于95%的AlkB蛋白,其酶学性质参数如...     

乙型肝炎病毒靶向核糖核酸酶及其突变体的原核表达和活性分析

目的：研究原核表达的乙型肝炎病毒（HBV）靶向核糖核酸酶（RNase）及其突变体（点突变失去RNase活性）的活性。方法：将构建的靶向核糖核酸酶及其突变体基因克隆入原核表达载体pET32a（＋）,转化大肠杆菌BL21（DE3）,以IPTG诱导融合蛋白（HBV核心蛋白与人嗜酸性粒细胞来源的神经毒素的融合蛋白）的表达;表达产物经包涵体纯化、SDS-PAGE和Western印迹鉴定,将纯化的蛋白用透析方法复性;以酵母tRNA为作用底物,应用复性的蛋白进行RNase活性分析。结果：纯化和复性了HBV靶向核糖核酸酶及其突变体;复性的HBV靶向核糖核酸酶可以降解酵母tRNA且具有剂量依赖性,而复性后的突变的靶向核糖核酸酶体不具有RNase活性。结论：原核表达的HBV靶向核糖核酸酶具有较强的RNase活性,为探索HBV靶向核糖核酸酶抑制乙肝病毒复制的机理奠定了基础。     

人肝再生增强因子在毕赤酵母中的表达、纯化和生物学活性的研究

肝再生增强因子（ALR）是一类胞源性肝细胞生长因子。为在毕赤酵母中分泌表达人肝再生增强因子（rhALR）,以色谱法分离纯化后进行体外活性研究,构建表达载体pPICZαA- ALR,经电穿孔转入毕赤酵母中,用0.5％甲醇诱导表达;重组酵母培养上清经SDS-PAGE电泳和western blot鉴定后表明, rhALR以分子量为30kD的二聚体为主;定量分析结果表明,重组酵母培养上清中rhALR约占总蛋白的66％,表达量约为40mg/L;经DEAE柱和G75柱纯化后,获得的rhALR纯度大于95％,得率为52％;体外生物学活性实验表明,rhALR能明显促进HepG2、SMMC-7721和NIH-3T3细胞的增殖。     

sTNFRⅡ和VIP融合蛋白的基因克隆表达、纯化及活性检测

可溶性肿瘤坏死因子受体Ⅱ（sTNFRⅡ）和血管活性肠肽（VIP）对类风湿性关节炎（RA）均有治疗作用,但两者的作用机制不同。制备两者融合表达蛋白,可能具有更好的防治类风湿关节炎的作用。用含有VIP全基因序列的上游引物和sTNFRⅡ的下游引物,用PCR扩增出由连接序列将VIP和sTNFRⅡ基因连接的片段,再亚克隆到原核表达载体pET32a,在大肠杆菌DH5α内诱导表达。表达的产物经离子交换、疏水层析纯化,并用体外中和试验检测其活性。结果显示：构建的pET32a-VIP-sTNFRⅡ表达载体在大肠杆菌DH5α内包涵体表达,离子交换层析纯化后的融合蛋白有较强的生物活性,为将来应用打下基础。     

人分泌磷蛋白2基因的克隆、原核表达与活性检测

提取人肝癌组织RNA,通过RT-PCR扩增人SPP2成熟蛋白编码区基因并克隆至原核表达载体pET-22b（＋）,将测序正确的质粒转化大肠杆菌BL2l（DE3）,IPTG诱导重组蛋白表达,用Ni-NTA柱进行纯化,SDS-PAGE电泳及Western blot检测并证实目的蛋白的表达,通过重组蛋白对木瓜蛋白酶的抑制作用验证其生物学活性。重组质粒测序和酶切结果显示SPP2成熟蛋白基因已成功克隆到pET-22b（＋）。IPTG诱导重组菌后有25kDa大小的目的蛋白表达。优化诱导表达条件,获得可溶性表达的目的蛋白,纯化后纯度达90%,western blot表明其具有His标签抗原活性。重组SPP2成熟蛋白可抑制木瓜蛋白酶的水解作用（酪蛋白为底物）,重量抑制比为1∶3.1,抑制比活性为2511U/mg。     

节杆菌乙内酰脲水解酶与GST蛋白融合表达及纯化

目的：构建节杆菌BT801乙内酰脲水解酶（HyuH）与GST融合表达载体,利用大肠杆菌表达GST-HyuH融合蛋白并纯化。方法：将节杆菌HyuH基因插入载体pGEX-KG构建重组表达质粒pGEX-KG-HyuH;SDS-PAGE检查GST-HyuH的表达;利用薄层层析检查融合蛋白的HyuH活性;最后利用谷胱甘肽-Sepharose 4B树脂纯化融合蛋白GST-HyuH。结果：SDS-PAGE表明重组菌在相对分子质量77×103处有特异的蛋白表达条带,且重组菌可以水解5-苯基乙内酰脲,纯化得到了有HyuH活性的纯度较高的GST-HyuH融合蛋白。结论：得到了有HyuH活性的GST-HyuH,为进一步研究HyuH的修饰奠定了基础。     

Nm23-H1/NDPK-A基因在大肠杆菌中的高效表达及产物纯化的研究

利用聚合酶链反应（ＰＣＲ）技术扩增人二磷酸核苷激酶Ａ亚基（ＮＤＰＫ－Ａ）基因,即ｎｍ２３－Ｈ１／ＮＤＰＫ－Ｋ基因的编码序列,经序列分析后,定向克隆于表达质粒载体ｐＢＶ２２０,在大肠杆菌ＤＨ５α中高效表达出重组人ＮＤＰＫ－Ａ．表达产物为可溶性的非融合蛋白,占菌体总蛋白４２％．斑点ＥＬＩＳＡ法鉴定表明表达产物与ＮＤＰＫ－Ａ标准抗血清呈阳性反应．以ＤＥＡＥ纤维素弱阴离子交换层析、ＣｉｂａｃｒｏｎＢｌｕｅ染料亲和层析结合高效液相排阻色谱技术纯化ｒＮＤＰＫ－Ａ,得纯度为９６．７％的目标蛋白．以反相高效液相色谱法进行酶活性分析,表明纯化的ｒＮＤＰＫ－Ａ能催化ＡＴＰ＋ＵＤＰ＝ＡＤＰ＋ＵＴＰ的反应,比活性为８００Ｕ／ｍｇ蛋白．