双歧杆菌质粒聚合酶基因对质粒载体稳定性的影响

目的探讨双歧杆菌天然质粒的聚合酶基因（Bifidobacterium plasmid polymerase,BPP）对人工构建的大肠埃希菌～双歧杆菌穿梭质粒载体（shuttle vector）在长双歧杆菌中稳定性的影响。方法首先电转化质粒pBADs—A和pBADs-BPP至长双歧杆菌,培养鉴定后,接种含质粒pBADs—A和pBADs-BPP的双歧杆菌于AMP^-和AMP^＋的MRS培养液中。厌氧培养后,将样品涂布于AMP^＋的MRS固体培养板上计数菌落数。结果相同条件下质粒pBADs·BPP组菌落数高于质粒pBADs—A组（P〈0．05）。结论BPP可以增加质粒载体的稳定性。     

双歧杆菌质粒聚合酶基因表达系统的构建及其鉴定

目的构建可以在双歧杆菌表达外源性基因的系统。方法PCR扩增双歧杆菌质粒聚合酶基因（BPP）并连接至质粒pBS—T以形成重组质粒pBS—BPP。PCR扩增双歧杆菌内源性阿拉伯糖苷酶的启动子及分泌性信号肽DNA序列（ara）并连接至质粒pBAD—A以形成重组质粒pBAD—ara,然后将增强绿色荧光蛋白（eGFP）基因连接至质粒pBAD—ara以形成重组质粒pBAD—ara—GFP。采用基因重组技术重组含有ara、BPP、eGFP基因序列并可将外源性基因分泌表达于菌体外及锚定表达于细胞壁的质粒pBS—BPP—ara—GFP,激光共聚焦显微镜下观察含有pBS—BPP—ara—GFP质粒及对照质粒的E．coli,验证eGFP定位表达情况。结果所构建的表达系统可以在E．coli中表达eGFP基因。结论通过基因重组方法成功构建了双歧杆菌表达系统,其可将外源基因分泌表达于菌体外。     

基因工程双歧杆菌的研究及其应用

双歧杆菌（Bifidobacterium）是哺乳动物体内重要益生菌群之一,主要定植在下消化道,在长期进化过程中与宿主形成了一个和谐的依存关系,对维持肠道的微生态平衡起重要作用。它在体内具有预防和治疗腹泻、减轻便秘和乳糖不耐性症状、提高机体免疫力、抑制肿瘤发生和减少胆固醇、抗感染等多方面作用。     

一株双歧杆菌质粒聚合酶基因的PCR扩增和鉴定

目的PCR扩增人双歧杆菌天然质粒的聚合酶基因。方法用改良型MRS双歧杆菌选择培养基,从人新鲜粪便分离长双歧杆菌,PCR扩增长双歧杆菌质粒聚合酶(Bifidobacterium plasmid polymerase,BPP)基因,对BPP基因检测阳性的PCR产物通过序列分析,进行鉴定。结果人长双歧杆菌天然质粒的聚合酶基因PCR扩增后,经1.0%琼脂糖凝胶电泳,测得BPP基因的相对分子质量约为1.9 kb。通过BLAST序列比对分析与GenBank中相应基因同源性为96%。结论成功克隆了1株双歧杆菌天然质粒的聚合酶基因,为构建与双歧杆菌宿主质粒相适应的载体奠定了基础。     

sTNFRⅡ和VIP融合蛋白的基因克隆表达、纯化及活性检测

可溶性肿瘤坏死因子受体Ⅱ（sTNFRⅡ）和血管活性肠肽（VIP）对类风湿性关节炎（RA）均有治疗作用,但两者的作用机制不同。制备两者融合表达蛋白,可能具有更好的防治类风湿关节炎的作用。用含有VIP全基因序列的上游引物和sTNFRⅡ的下游引物,用PCR扩增出由连接序列将VIP和sTNFRⅡ基因连接的片段,再亚克隆到原核表达载体pET32a,在大肠杆菌DH5α内诱导表达。表达的产物经离子交换、疏水层析纯化,并用体外中和试验检测其活性。结果显示：构建的pET32a-VIP-sTNFRⅡ表达载体在大肠杆菌DH5α内包涵体表达,离子交换层析纯化后的融合蛋白有较强的生物活性,为将来应用打下基础。     

荧光分子信标探针检测拉米夫定耐药基因的研究

建立荧光分子信标探针方法,探讨乙肝病毒对拉米夫定耐药的发生及病程进展。观察77例乙肝病人口服拉米夫定治疗前及治疗后12个月及24个月肝功能(ALT)及免疫学指标及检测HBVDNA含量,并采用PCR荧光分子信标技术检测YMDD耐药突变株(包括YIDDYVDD突变株)。结果表明,口服拉米夫定12个月或24个月,近半数病人血清HBVDNA转阴(小于01pgml),35%(2777)的病人出现e抗原血清转换或单纯e抗原转阴,而e抗原血清转换绝大多数发生于HBVDNA低于100pgml血清的病人。30%(2376)的病人出现YMDD耐药(YIDDYVDD),在HBVDNA小于10pgml(106拷贝ml)的病人中YMDD耐药株与野生株共存。加大口服拉米夫定剂量,绝大多数YMDD耐药株仍不能转变为YMDD野生株。提示中国乙肝患者YMDD耐药后不适合加大剂量继续使用拉米夫定治疗 。     

利用GFP示踪细胞内源性P53活性检测DNA损伤

ＤＮＡ损伤的检测对预防癌症和遗传病等非常重要。采用分子克隆技术,将报告基因—绿色荧光蛋白（ＧＦＰ）置于ＳＶ４０基本启动子调控下,构建成对照载体ｐＳＶ－ＧＦＰ。在ＳＶ４０基本启动子上游插入寡核苷酸Ｐ５３ＲＥ,构建成示踪载体ｐ５３ＲＥ－ＧＦＰ。转染ＮＩＨ３Ｔ３细胞,以ＧＦＰ示踪细胞内源性Ｐ５３的转录激活活性。紫外线照射或Ｈ２Ｏ２处理转化细胞使ＤＮＡ损伤,诱导细胞内源性Ｐ５３的表达。用激光扫描共聚焦成像系统（ＬＳＣＩＳ）对细胞进行红、绿、蓝三色光融合成像,并测定ＧＦＰ经４８８ｎｍ激发后发出的绿色荧光光密度,验证ＧＦＰ示踪Ｐ５３的特异性。ｐ５３ＲＥ－ＧＦＰ转化细胞３Ｔ３－ＲＥＧ经紫外线照射或Ｈ２Ｏ２处理后,ＧＦＰ的表达增高,处理后１ｈｒ光密度即达到最高水平,随后逐渐降低。血清“饥饿”—非ＤＮＡ损伤处理的３Ｔ３－ＲＥＧ细胞,以及经紫外和Ｈ２Ｏ２处理的对照载体ｐＳＶ－ＧＦＰ转化细胞３Ｔ３－ＳＶＧ,ＧＦＰ的表达无明显增强。实验表明：ＧＦＰ示踪内源性Ｐ５３转录激活活性用于检测ＤＮＡ损伤有很高的灵敏度和特异性,适宜推广应用。     

双歧杆菌的完整肽聚糖对小鼠腹腔巨噬细胞细胞骨架的影响

目的探讨双歧双歧杆菌的完整肽聚糖（WPG）对巨噬细胞细胞骨架的影响。方法首先分离培养昆明小鼠腹腔巨噬细胞,然后以WPG刺激巨噬细胞后,用荧光标记的鬼笔环肽染液染色,最后采用激光共聚焦显微镜技术检测巨噬细胞的细胞骨架。结果和对照组相比,WPG刺激巨噬细胞后,其胞内肌动蛋白减少且排列更加紊乱,同时胞膜荧光强度减弱,胞外放射状荧光物质减少,甚至消失。结论双歧双歧杆菌的WPG在激活巨噬细胞的过程中可影响其细胞骨架。     

NASBA荧光分子信标技术定量检测丙型肝炎病毒

建立NASBA荧光分子信标探针检测技术,并对国家HCV标准品、人工构建HCVRNA野生株及HCV抗体阳性不同人群进行检测。实验结果:该方法检测HCV的灵敏度为103拷贝ml血清,阴性参比品的符合率为100%;检测的线性范围为103拷贝～109拷贝ml血清;精密性(CV值)小于6%,在HCV抗体阳性人群中HCVRNA的检出率在45%～65%之间。结论:该方法在HCVRNA临床定量检测中具有良好的灵敏度、特异性、重复性与实用性。