感受态细胞制备与保存方法的比较研究

目的 :确立一个能制备高转化率感受态细胞并长期维持其感受性的实验方案。方法 :比较CaCl2 法、TSS法、超高效法制备感受态细胞的效果 ,选用三者中较好的方法进一步探讨不同生长期 (OD值 0 .2～ 1.1)的细菌对制备感受态细胞的影响 ,并分别比较了不同冷冻保护剂 (7%DMSO ,10 %甘油 )于 - 2 0℃、- 80℃冰箱保存感受态细胞的效果。结果 :三种方法获得的感受态细胞转化率差异极显著 (P <0 .0 1)。采用超高效法 ,OD值为 0 .36 (或 0 .5 8)时收集菌体可获得 1.1× 10 8的高转化率的感受态细胞 ,以 7%的DMSO为冷冻保护剂保存感受态细胞可维持 10 7以上的转化率 4 0d以上     

尿酸酶在大肠杆菌高密度表达的工艺优化

[目的]利用大肠杆菌高密度表达尿酸酶进行发酵培养,预构建一种高效、低成本生产尿酸酶的工艺路线。[方法]构建重组尿酸酶大肠杆菌体系,活化种子液,设计不同的接种量、培养温度,绘制生长曲线;种子液接种至不同p H值的培养基中进行诱导表达;种子液中加入不同浓度的IPTG诱导剂。[结果]10%的接种量细胞的OD_(600)为3. 348;菌体在37℃的培养环境下OD_(600)达到3. 8。培养基的初始pH值在7. 5时,尿酸酶的表达量达到25%以上。种子液加入0. 8 mmol/L的IPTG后,尿酸酶的表达量超过40%,持续培养6 h后,菌体OD_(600)为2. 9。[结论]与之前工艺对比,经过工艺优化之后,尿酸酶的表达量增超过25%,大肠杆菌的OD_(600)达到3. 0左右。     

少量制备大肠杆菌感受态细胞条件探索

目的:为了获得重复性好、转化率高的少量制备感受态细胞的方法,利用不同生长时期的大肠杆菌感受态细胞,进行转化比较。方法:根据普通实验室的实验条件,常规方法提取质粒,氯化钙法转化不同生长时期的大肠杆菌感受态细胞,比较转化率。结果:大肠杆菌感受态细胞的转化率与OD值显著相关,在OD600nm为0.39和0.55时转化率最高,在OD600nm为0.28~0.55之间均可得到理想的转化效果。结论:少量制备感受态细胞方法操作中无需添加任何保护试剂和细胞复苏培养,操作简便、重复性好,实验成本低廉。     

工业谷氨酸棒杆菌电转化整合效率的优化

研究不同因素对谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)电转化效率的影响,探讨电转化的最适条件,提高电转化效率。以产L-异亮氨酸的谷氨酸棒杆菌工业菌株a11为受体菌,大肠杆菌(Escherichia coli)JM109及质粒pk18mobsac B为载体,通过电转化方法研究了菌体最佳感受态性能、复苏培养基高渗溶液浓度、最适电场强度及电击后的热激培养对电转化效率的影响。对于谷氨酸棒杆菌a11而言,使用无痕的自杀载体电击转化,在感受态细胞OD_(600 nm)值为1.0~1.2,电场强度达到9.0 kV/cm,电转后46℃热激培养8 min,而且热激后继续保持37℃的适应性培养,电转化效率最高,达到1.8×10~3cfu/μg DNA。实现了工业谷氨酸棒杆菌的电转化效率的提高,也为其它谷氨酸棒杆菌电转化效率的提高提供参考方法。     

大肠杆菌JM109感受态形成因素分析

目的:分析大肠杆菌JM109感受态形成因素,提高转化效率。方法:采用不同生长状态、不同转化溶液、不同保存时间及热激处理时间的细菌制备感受态,分析转化效率。结果:以20mmol/L MgCl2 80mmol/L CaCl2为处理液,经活化培养OD600为0.82的菌液制备感受态细胞,4℃放置12~24h之内,42℃热激处理60s,转化效率最高,可达9.8×106~1.2×107cfu/μg DNA(pUC19)。随着质粒长度增加,转化效率下降。结论:感受态细胞形成与生长状态关系密切,金属离子、有机溶剂对感受态的形成影响显著。感受态形成过程中,细胞可能发生了一系列的生理变化。     

制备高效大肠杆菌电转化感受态细胞和电转化条件的研究

旨在建立一种高效大肠杆菌电转化感受态细胞的制备方法,研究了摇瓶装液量,菌体生长阶段,转化电场强度,转化后复苏时间以及感受态细胞存放时间等对转化效率的影响.结果表明,基液量为400 mL/2L,菌体在OD600值为0.452时收集所制备的感受态细胞,在电场强度12.5 kV/cm条件下电击5 ms,转化后复苏时间2h,转化效率可达到1010CFU/μg DNA.此条件下制备的感受态细胞转化效率高,质量稳定,重复性好.     

真空渗透法转化油菜及转化种子的筛选

真空渗透遗传转化法首先在拟南芥(Arabidopsis thaliana)中获得成功, 是一种简便、快速且无需经过组织培养阶段即可获得大量转化植株的基因转化方法。该研究以不同遗传背景的3个甘蓝型油菜(Brassica napus)品种(系)陕3B、L45和Mg23为材料, 对真空渗透遗传转化方法中真空渗透时间和Silwet L-77浓度与遗传转化效果的关系进行了比较, 同时对转化种子的筛选方法进行了优化。结果表明, 卡那霉素(Km)对油菜种子的萌发影响不显著, 但对其生长发育有明显的抑制作用。不同油菜品种对卡那霉素的敏感性不同, 各自的致死浓度也不一样。在0%-0.05%的浓度范围内, 随着Silwet L-77浓度的增加, 在相同的真空渗透时间内, 3个油菜品种的转化率逐渐升高。当Silwet L-77浓度为0.05%时, 10分钟的真空渗透时间可获得最高转化效率, 此时陕3B、L45和Mg23的转化率分别达到1.97%、2.09%和2.30%。     

真空渗透法转化油菜及转化种子的筛选

真空渗透遗传转化法首先在拟南芥(Arabidopsis thaliana)中获得成功,是一种简便、快速且无需经过组织培养阶段即可获得大量转化植株的基因转化方法。该研究以不同遗传背景的3个甘蓝型油菜(Brassica napus)品种(系)陕3B、L45和Mg23为材料,对真空渗透遗传转化方法中真空渗透时间和Silwet L-77浓度与遗传转化效果的关系进行了比较,同时对转化种子的筛选方法进行了优化。结果表明,卡那霉素(Km)对油菜种子的萌发影响不显著,但对其生长发育有明显的抑制作用。不同油菜品种对卡那霉素的敏感性不同,各自的致死浓度也不一样。在0%-0.05%的浓度范围内,随着Silwet L-77浓度的增加,在相同的真空渗透时间内,3个油菜品种的转化率逐渐升高。当Silwet L-77浓度为0.05%时,10分钟的真空渗透时间可获得最高转化效率,此时陕3B、L45和Mg23的转化率分别达到1.97%、2.09%和2.30%。     

一种用质粒DNA转化大肠杆菌感受态细胞的实用操作技巧

目的是建立一种简化、实用的用质粒DNA转化大肠杆菌的操作方法.采用氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞.以质粒pUC18,pCSN44,pAN52-1Not,pETts,pANth和植物双元表达栽体pCAMBIA1301分别转化用于质粒扩增与保存的常用大肠杆菌菌株Top10和DH5α以及用于原核表达的常用大肠杆菌菌株BL21(DE3)和TB1.质粒与感受态细胞的混合液置冰上作用一定时间后,直接涂布含有筛选抗生素的LB平板,于37℃培养12～16h.结果表明,用不同大小的质粒DNA转化不同的大肠杆菌菌株,都可以获得满足实验要求,转化效率可高达103～4阳性克隆/μg.该方法较标准的转化流程更加简便、省时、实用.     

大肠埃希菌TG_1电穿孔法转化条件优化研究

为了确立稳定的高效率电转化方案,提高构建文库的库容,分别对细菌培养温度、生长状态、电场强度、感受态细胞浓度和体积、外源基因的质量、甘油/甘露醇缓冲液体积等条件进行优化,分析了各因素对转化效率的影响。结果显示:细菌培养温度为16℃,细菌生长的OD_(600)值为0.5,密度梯度离心洗涤法,感受态细胞浓度高于1×10~(11)/m L,并设定电场强度14.25 k V/cm时进行电穿孔,转化效率最高,可达到9×10~9CFU/μg DNA。研究获得的电转化优化条件为高库容文库的构建提供了一个重要的途径。     

枯草芽孢杆菌SCK6超级感受态的制备和转化条件优化

枯草芽孢杆菌是一种革兰氏阳性好氧细菌,因其安全性和高分泌特性,已被广泛用作异源蛋白的表达宿主。然而,相比大肠杆菌,枯草芽孢杆菌的转化效率低,限制了其作为宿主的异源蛋白的定向进化。本文通过改变培养基、诱导剂浓度、质粒类型等参数优化感受态制备的条件,利用常规质粒进行转化,结果表明,用营养丰富的YN培养基替代常规LB培养基制备感受态,可以使转化效率提高4倍左右;加入1.5%的木糖诱导2 h,感受态的转化效率又提高2倍左右;用大肠杆菌Escherichia coli GM272来源的质粒又可进一步提高转化效率3倍左右。综合最优条件制备SCK6的感受态,转化整合型质粒pDG1730,效率可以达到10~6 CFU/μg,相对未优化的条件提高了2个数量级,为基于枯草芽孢杆菌的酶的定向进化和代谢工程奠定了基础。     

大肠杆菌磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸转移酶系统改造对产L-色氨酸的影响

L-色氨酸是芳香族氨基酸的一种,被广泛应用于医药、食品和饲料等领域。大肠杆菌磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸转移酶系统(PTS系统)在葡萄糖转运和磷酸化过程中起重要作用,是糖代谢基因表达调控的核心。利用Red同源重组系统,构建包含两类典型PTS系统突变(ptsHIcrr~-glf-glk~+和ptsG~-)的L-色氨酸生产菌,并对相关菌株进行补料分批发酵研究。结果表明,不同类型PTS系统突变对菌体生长、L-色氨酸产量、糖酸转化率及副产物生成均有较大影响。与出发菌相比,ptsHIcrr~-glf-glk~+突变株最高OD_(600)达到125,提高47.0%,产酸38.5 g/L,提高25.9%,糖酸转化率16.7%,提高26.5%,乙酸生成略有增加;ptsG~-突变株最高OD_(600)达到100,提高17.6%,产酸33.4 g/L,提高9.4%,糖酸转化率15.5%,提高17.4%,乙酸生成略有减少。对葡萄糖转运系统的进一步研究将为大肠杆菌合成L-色氨酸效率的提升提供帮助。     

大肠杆菌感受态细胞转化能力的影响因素

探讨了大肠杆菌菌株、细菌生长状态、转化溶液、抗冻剂及保存时间、质粒长度和纯度对感受态细胞转化能力的影响。结果表明,以100 mmol/L CaCl2为缓冲液,采用经活化培养的A600为0.55的TG1制备的感受态细胞,在冰上放置6h后转化,所得转化率最高,可达2×106-4×107cfu/μg DNA(pUC19)。随着质粒长度增加和纯度降低,转化率有所下降。若感受态细胞要保存备用,以15％甘油为抗冻剂优于7％DMSO,但添加抗冻剂对转化率有抑制作用。贮于甘油的感受态细胞在-70℃冻存两个月后仍有较理想的转化率。     

大肠杆菌最佳感受态细胞制备的探讨

本文对４种大肠杆菌菌株在不同生长时期的转化效率分别进行了测定．结果表明,在细菌的生长繁殖过程中,其转化效率是有很大变化的．对于不同的菌株,它们获得高转化率时的活菌数不同．同时,得到了这４种大肠杆菌菌株制备最佳感受态细胞的条件．     

蔗糖转运蛋白基因VvSUC11和VvSUC12双价植物表达载体的构建及在甜菜中的遗传转化

将葡萄Vitis vinifera L.的蔗糖转运蛋白基因VvSUC11和VvSUC12与甘薯Ipomoea batatas L. Lam.的甘薯贮藏蛋白 (Sporamin) 基因的根部特异性启动子命名为SP1和SP2重组。以pCAMBIA2301为起始载体,构建了pCAMBIA2301- SP1-VvSUC11-SP2-VvSUC12用农杆菌介导法转化了甜菜Beta vulgaris L.品种KWS-9103,发现预培养4 d,侵染时农杆菌的浓度OD600值为0.5,附加0.005％表面活性剂Silwet L-77,延迟筛选4 d,转化效率最高,可达42％。对在卡那霉素中分化并生根的甜菜植株进行PCR和RT-PCR检测,证明目的基因已整合到甜菜中并表达,为进一步研究该基因在甜菜Beta vulgaris中的功能奠定了基础。     

双歧杆菌感受态细胞的制备和电转化条件的研究

介绍目前常用的双歧杆菌感受态细胞制备方法,并系统研究影响双歧杆菌电转化效率的关键因素。通过研究,菌体在4oo为0.3-0. 5时收集以制备感受态细胞,制备好的感受态细胞应尽早用于电转化;最佳电场强度为12.5 kV/cm;转化后的细胞复苏培养2 h为佳。感受态细胞的转化效率可达103 CFU/μg DNA。     

热葡糖苷酶地芽胞杆菌NCIMB 11955高效电转感受态细胞电转体系的建立

热葡糖苷酶地芽胞杆菌(Geobacillus thermoglucosidasius)是一种革兰氏阳性兼性厌氧菌,因其高温生长速度快、不易染菌的特性,作为下一代工业生物技术的候选底盘,已被广泛用于生产生物燃料和高附加值的化学品。然而,相比于经典的模式菌株大肠杆菌(Escherichia coli),热葡糖苷酶地芽胞杆菌因其转化效率低,限制了其作为底盘菌株的高效应用。本研究的目的是开发一种能够提高该菌株电转化效率的方法。本研究通过敲除该菌株中预测的限制性内切酶基因,添加细胞壁弱化剂和细胞膜抑制剂,优化目标菌株高效感受态细胞的制备,从而提高转化效率。热葡糖苷酶地芽胞杆菌的4个限制性内切酶基因的敲除可以使感受态细胞电转化效率提高至1.2×10^(4)CFU/(μg DNA);在敲除株的基础上,分别通过添加吐温80、DL-苏氨酸和甘氨酸进一步优化感受态细胞转化效率,其中吐温80的添加使感受态细胞电转化效率提高22.5倍左右,DL-苏氨酸的添加可以使感受态细胞电转化效率增加44倍,甘氨酸的添加可以使感受态细胞电转化效率进一步提高334倍左右,优化整合添加各类试剂后感受态细胞电转化效率在限制性内切酶缺失菌株的基础上提高至4.6×10^(6)CFU/(μg DNA),相对野生型菌株提高了3个数量级。这为热葡糖苷酶地芽胞杆菌的高效遗传操作和代谢工程奠定了基础。     

3种假单胞菌CaCl2法感受态细胞制备及转化条件

假单胞菌因其生境和代谢类型的多样性,在污染环境修复、生物转化、生物防治等领域具有广阔的应用潜力;外源基因的导入是假单胞菌遗传改造的重要环节,而感受态细胞的制备和转化方法的建立是导入外源基因的重要方法学基础.本研究以从石油污染土壤中分离筛选的假单胞菌属的3个菌株Pseudomonas putida TS11、P.stutzeri DNB、P.mendocina JJ12为对象,通过3因素4水平正交实验设计,研究了不同CaCl2浓度、热激时间及复苏时间对不同假单胞菌感受态细胞制备及转化效率的影响.结果表明:CaCl2浓度是影响假单胞菌转化效率的最主要因素(P＜0.05),且在制备感受态细胞之前用无菌蒸馏水多次洗涤菌体细胞,转化率明显提高.3种假单胞菌的CaCl2转化优化条件分别为:100 mmol·L-1 CaCl2,热激3 min,复苏1.5 h;50 mmol·L-1 CaCl2,热激6 min,复苏1.5 h;75 mmol·L-1 CaCl2,热激4.5 min,复苏0.5h.在上述转化条件下,3种假单胞菌的外源质粒转化效率均达到105个转化子·μg-1DNA水平.     

循环利用重组大肠杆菌细胞转化合成丁二酸

研究了回收丁二酸发酵液中的大肠杆菌进行细胞转化的可行性,以转化率和生产效率为指标,考察了不同菌体浓度、底物浓度、pH调节剂对细胞转化的影响。发酵结果表明大肠杆菌可以在仅含有葡萄糖和pH调节剂的水环境中转化生产丁二酸,并确定了最佳的转化条件为:细胞浓度(OD600)50,底物浓度40g/L,缓冲盐为MgCO3。基于优化好的条件,在7L发酵罐中进行重复批次转化,第1次转化的转化率和生产效率分别达到91%和3.22g/(L·h),第2次转化的生产效率和转化率达到了86%和2.04g/(L·h),第3次转化的转化率和生产效率分别达到了83%和1.82g/(L·h)。     

利用人工Mu转座技术研究解淀粉芽孢杆菌的功能基因

目的:利用人工Mu转座技术研究解淀粉芽孢杆菌的功能基因。方法:使用加入0.5%甘氨酸的M9-YE培养基,细菌生长到D600nm值为0.5时制备感受态细胞,加入Mu转座复合物(含42ngMuDNA),以1.8kV电压电击获得转化子。对转化子进行功能突变表型筛选、基因克隆、DNA序列分析,以确定插入突变的功能基因。结果:获得最佳电转化效率1.9×103CFU/μgDNA。同时获得2个芽孢杆菌抑真菌作用的调节基因rpmGA和yxlC。结论:人工Mu转座技术是研究芽孢杆菌功能基因的快速有效的好方法。