3种假单胞菌CaCl2法感受态细胞制备及转化条件

假单胞菌因其生境和代谢类型的多样性,在污染环境修复、生物转化、生物防治等领域具有广阔的应用潜力;外源基因的导入是假单胞菌遗传改造的重要环节,而感受态细胞的制备和转化方法的建立是导入外源基因的重要方法学基础.本研究以从石油污染土壤中分离筛选的假单胞菌属的3个菌株Pseudomonas putida TS11、P.stutzeri DNB、P.mendocina JJ12为对象,通过3因素4水平正交实验设计,研究了不同CaCl2浓度、热激时间及复苏时间对不同假单胞菌感受态细胞制备及转化效率的影响.结果表明:CaCl2浓度是影响假单胞菌转化效率的最主要因素(P＜0.05),且在制备感受态细胞之前用无菌蒸馏水多次洗涤菌体细胞,转化率明显提高.3种假单胞菌的CaCl2转化优化条件分别为:100 mmol·L-1 CaCl2,热激3 min,复苏1.5 h;50 mmol·L-1 CaCl2,热激6 min,复苏1.5 h;75 mmol·L-1 CaCl2,热激4.5 min,复苏0.5h.在上述转化条件下,3种假单胞菌的外源质粒转化效率均达到105个转化子·μg-1DNA水平.     

长白山原始红松林次生演替过程中土壤微生物生物量和酶活性变化

采用空间代替时间的方法,以我国东北地区温带森林长白山原始阔叶红松林成熟林(200年)和过熟林(＞200年)及其次生演替不同阶段——白桦幼龄林(20年)、白桦中幼龄林(30年)、白桦中龄林(50年)、白桦成熟林(80年)和白桦过熟林(100年)为研究对象,分析了长白山原始阔叶红松林次生演替过程中土壤有机碳、土壤微生物生物量碳、氮、磷及土壤酶活性变化.结果表明:白桦幼龄林和白桦成熟林的土壤腐殖质层(A层)有机碳含量最高,分别为154.8和154.3 g·kg-1,而顶极群落原始阔叶红松林A层有机碳含量相对较低,成熟林和过熟林分别为141.8和133.4 g·kg-1.白桦中龄林和白桦成熟林的微生物生物量碳和微生物熵均高于其他林地,纤维素酶、过氧化物酶、酸性磷酸酶和纤维二糖酶的活性到中龄林和成熟林达到最高,而此阶段的多酚氧化酶活性最低,提示白桦中龄林及白桦成熟林土壤有机碳周转速度快,土壤有机碳可能处于较强的积累过程中.统计分析表明,土壤微生物生物量碳与土壤有机碳、全氮和有效磷含量之间呈极显著正相关(r分别为0.943、0.963和0.953,P＜0.01).     

三元(碱-表面活性剂-聚合物)复合驱油藏采出水微生物群落特征

与水驱技术相比,向油藏中注入碱、表面活性剂和聚合物(简称三元复合驱,ASP)能大幅提高石油采收率,但这些驱油剂对油藏中微生物多样性与群落结构的影响尚亟待阐明,这对油田水质管理与腐蚀控制均具有的重要意义. 本研究采用高通量测序技术解析了大庆油田ASP油藏4口油井采出水中的微生物多样性与群落结构. 结果表明: ASP油藏采出水的pH高达9.65. 采出水中微生物Shannon多样性指数为2.00～3.56,采出井间菌群多样性存在差异. 在门、纲、属分类水平上,变形菌门(85.5%～98.3%)、γ-变形菌纲(83.7%～97.8%)、栖碱菌属(51.8%～82.5%)是绝对优势菌群. 共检测到12个属的潜在硫化氢产生菌,以硫磺单胞菌属丰度最高(0.4%～7.4%). 与已发表的水驱油藏研究结果相比,三元复合驱油藏采出水微生物群落组成独特,呈嗜/耐碱趋势,其多样性偏低,群落结构更单一.     

原生质体融合构建高效产脂肽工程菌

芽孢杆菌因其可产生多种生理活性物质,在环境污染修复、生物防治、微生物采油等领域具有广阔的应用前景。莫哈韦芽孢杆菌Bacillus mojavensis JF-2和解淀粉芽孢杆菌B. amyloliquefaciens BQ-6是从油田筛选出的产脂肽类表面活性剂菌株, 但在微生物采油实际应用中受到氧气浓度、盐度及pH的限制。原生质体融合是改变微生物代谢功能的一种简便有效的方法,以上述两株芽孢杆菌为对象,利用4因素3水平正交试验来探索菌龄、溶菌酶浓度、酶解温度和酶解时间对原生体制备、再生的影响。此外,对两菌株进行了双亲灭活原生质体融合,通过筛选得到了一株工程菌HY-4,并对其进行了初步的评价。结果表明:菌龄、溶菌酶浓度和酶解时间显著影响芽孢杆菌原生质体制备率及再生率(P<0.05),且在溶菌酶处理前用生理盐水多次洗涤菌体细胞,可提高制备率。两种芽孢杆菌原生质体制备及再生的最优条件均为:菌龄7 h、溶菌酶浓度2.5 mg/ml、酶解时间30 min、酶解温度42 ℃。融合子HY-4的最高耐盐度为15%,可耐50 ℃高温,代谢产脂肽的pH范围为4.0~9.5,且在好氧及厌氧条件下均能够代谢产脂肽,在厌氧条件下生长迅猛(细胞干重>1.6 g/L)。综上所述,融合子HY-4具有较大的应用潜力,该研究为芽孢杆菌的遗传育种打下了方法学基础,并对驱油微生物菌种的选育具有指导意义。     

硫酸盐还原菌对水解聚丙烯酰胺黏度的影响

目的:研究硫酸盐还原菌对油田驱油用水解聚丙烯酰胺体系黏度的影响.方法:以油田回注水配制不同分子量的HPAM溶液,考察硫酸盐还原菌在不同分子量聚合物中的生长繁殖情况及对HPAM溶液黏度的影响.结果:中分、高分、超高分HPAM-采出水体系初始黏度为21.7、25.4、38.9mPa·s.低于灭菌处理的23.0、27.8、45.8mPa·s.上述体系黏度在24h内明显下降.SRB的数量也由初始的3.0×103cfu/mL降低至10～102cfu/ml.结论:短期内SRB对高浓度的HPAM降解作用有限.SfUB培养物中的Fe2+是造成HPAM黏度下降的主要原因.SRB对HPAM黏度的影响是间接的.     

纳豆激酶的研究与应用

纳豆激酶是一种枯草芽孢杆菌产生的丝氨酸蛋白酶 ,具有强烈的纤溶活性 ,有望开发成为新型口服溶栓药。综述了纳豆激酶的生化特性、生物学活性、结构与功能及开发应用前景等。     

CO2浓度增加对长白山森林土壤甲烷氧化影响

大气CO2浓度升高可能对森林土壤的甲烷(CH4)氧化速率产生影响.本文采用开顶箱技术,对连续6年高浓度CO2(500 μmol·mol-1)处理的长白山森林典型树种蒙古栎树下土壤CH4氧化速率进行研究,并利用CH4氧化菌的16S rRNA特异性引物以及CH4单加氧酶功能基因引物分析了土壤中CH4氧化菌的群落结构与数量.结果表明:CO2浓度增高后,生长季土壤甲烷氧化量与对照和裸地相比分别降低了4％和22％;基于16S rRNA特异性引物的DGGE分析表明,CO2浓度增高导致两类甲烷氧化菌的多样性指数降低;CO2浓度增高对土壤中Ⅰ类甲烷氧化菌数量无显著影响,而使土壤中Ⅱ类甲烷氧化菌数量显著减少,功能基因pmoA拷贝数与对照和裸地相比分别降低了15％和46％.CO2浓度增高导致森林土壤甲烷氧化菌数量与活性降低,土壤含水量的增加可能是导致这一现象的主要原因.     

厌氧产脂肽工程菌的构建及其代谢活性评价

利用微生物产生生物表面活性剂驱油,是微生物采油的重要技术之一.但油藏的缺氧环境使得大多数生物表面活性剂产生菌的代谢活性受到限制.本研究以筛选自油田采出水中的好氧产脂肽类表面活性剂的解淀粉芽孢杆菌BQ-2和兼性厌氧的施氏假单胞菌DQ-1为亲本菌,通过原生质体融合的方法构建了一株能在厌氧条件下迅速生长并能产脂肽类表面活性剂的融合子JD-3.融合子JD-3的菌落形态与亲本菌株BQ-2相似,其16S rDNA序列与BQ-2的相似度达99%;在厌氧条件下培养36 h,融合子JD-3发酵液的表面张力由初始的63.0 mN·m^-1降至32.5 mN·m^-1;薄层层析及红外光谱分析结果显示,JD-3在厌氧条件下的产物为脂肽类表面活性剂;该表面活性剂的临界胶束浓度(CMC)为90 mg·L^-1,且对原油、液体石蜡、煤油等有较好的乳化活性.JD 3在厌氧条件下可以蔗糖、葡萄糖或甘油为碳源,以蛋白胨等为氮源合成脂肽类表面活性剂,且经多次厌氧传代培养仍保持稳定的产生物表面活性剂功能,显示该菌株在油藏厌氧条件下对提高原油采收率具有较好的应用潜力.     

一株源自渤海海域高温酸败油井采出水的硫酸盐还原菌筛选与活性抑制

【背景】海域油藏环境中硫酸盐还原菌(sulfate-reducing prokaryotes,SRP)的生长和代谢能够产生大量H_2S,引发酸败(souring)及微生物腐蚀等多方面的问题。但有关油藏生境中SRP的微生物多样性与生理活性及其危害控制的认识仍十分有限。【目的】深入了解我国渤海海域某高温酸败油藏中SRP的生理特点,探究SRP危害的控制策略。【方法】采用Hungate厌氧纯培养技术从渤海海域某高温酸败油井采出水中分离筛选SRP,并考察优势菌株的生理特点,综合16S rRNA基因序列比对分析菌株系统发育地位,着重评价不同杀菌剂及使用剂量对优势菌株产H_2S活性的抑制效力。【结果】酸败采出井的采出水中优势SRP菌株WJ_1的细胞呈长杆状,菌体长度为2.0-5.5μm,有运动性。WJ_1与解糖泽恩根氏菌(Soehngenia saccharolytica)模式菌株BOR-Y~T的16S rRNA基因序列一致性达99%。WJ_1最适生长温度约为37°C,能够耐受60°C高温;最适pH值约为8.0 (范围5.0-10.0),最适盐度约为0%-3%,盐度高于5%不能生长。WJ_1可利用丙酸钠、乳酸钠、乙酸盐等多种碳源,能以硫酸盐、亚硫酸盐、硫代硫酸盐为唯一电子受体产生H2S,不能利用单质硫。次氯酸钠(600 mg/L)、苄基三甲基氯化铵(600 mg/L)对WJ_1产H_2S活性无明显抑制效果。戊二醛(30 mg/L)、溴硝醇(10 mg/L)或四羟甲基硫酸磷(120 mg/L)可抑制WJ_1产H_2S活性达30 d以上。【结论】渤海海域某高温酸败油井采出水中优势SRP菌株WJ_1与S. saccharolytica BOR-Y~T的16S rRNA基因序列一致性最高,但两者生理特性差异明显;溴硝醇、戊二醛、四羟甲基硫酸磷是控制该酸败油井的潜在有效杀菌剂。     

微生物对油田污水-聚丙烯酰胺体系粘度的影响

比较了厌氧和曝气处理后的油田采出水配制聚丙烯酰胺溶液(采出水-聚丙烯酰胺体系)粘度及该体系中腐生菌,铁细菌和硫酸盐还原菌的数量变化。结果表明,曝气有利于聚合物溶液粘度的保持,粘度损失率明显低于厌氧采出水-聚合物体系。总体上,腐生菌或其代谢产物对聚合物粘度的影响很小;铁细菌可以利用聚合物生长,是破坏聚合物粘度的主要微生物类群;硫酸盐还原菌不能直接利用大分子量聚合物,可以利用小分子或分子链断裂的聚合物生长。