MicroRNA-29b过表达慢病毒载体的构建及其生物学特性的研究

目的:构建针对小鼠microRNA-29b过表达的慢病毒载体,研究其在小鼠神经元GT1-7细胞系中的生物学特性。方法:化学合成两条寡聚核苷酸单链,通过搭桥互补延伸成DNA双链,形成miR-29b的前体结构,将酶切后的慢病毒载体FUGW通过同源重组的方法与miR-29b的前体结构进行连接,构建相应microRNA-29b过表达慢病毒载体,并包装成病毒颗粒后转染小鼠神经元细胞系GT1-7,通过博来霉素药物筛选获得稳转株,RT-PCR检测相关基因在mRNA转录水平上表达量情况。结果:测序图谱证实重组慢病毒表达质粒f-F-miR-29b构建成功,GT1-7细胞稳转株中,miR-29b的表达量与对照组相比提高了约28倍,其靶基因DCX,Vdac1,Pten的表达量有所抑制,性发育相关基因LH-β,kiss-1,Inshulin,IGF-I,GPR54,GnRH,leptin-R没有明显变化。结论:利用慢病毒筛选的方法,成功在小鼠神经元GT1-7细胞中获得microRNA-29b过表达稳转株,为以后microRNA-29b的生物学特性的研究奠定了基础。     

慢病毒介导的下丘脑中过表达miR-505小鼠模型的构建

目的:本文用慢病毒定点注射的方法构建了在下丘脑中过表达mi R-505的小鼠模型,并利用荧光原位杂交方法在冰冻切片组织上快速检测mi RNAs,以确认慢病毒载体介导的mi R-505在丘脑中的表达能力。方法:实验小鼠在脑立体定位仪下定位到下丘脑位置,采用原位注射的方式进行慢病毒注射,注射后采用实时荧光定量RCR和应用了LNA探针和TSA系统的FISH(fluorescence in situ hybridization)技术,完成在慢病毒介导的mi R-505过表达老鼠下丘脑区域细胞中的mi R-505检测和示踪。结果:mi R-505慢病毒注射未成年小鼠下丘脑区5、10、20和40天后,均可检测到mi R-505在下丘脑区域的表达,且实验结果表明在慢病毒介导的过表达小鼠下丘脑注射部位,mi R-505表达量有明显的提高。结论:利用慢病毒注射未成年小鼠下丘脑脑区的方法,成功的建立了下丘脑中过表达mi R-505的小鼠模型,使用LNA标记探针的FISH方法探索mi RNA表达规律较稳定,且重复率高。     

双歧杆菌质粒聚合酶基因对质粒载体稳定性的影响

目的探讨双歧杆菌天然质粒的聚合酶基因（Bifidobacterium plasmid polymerase,BPP）对人工构建的大肠埃希菌～双歧杆菌穿梭质粒载体（shuttle vector）在长双歧杆菌中稳定性的影响。方法首先电转化质粒pBADs—A和pBADs-BPP至长双歧杆菌,培养鉴定后,接种含质粒pBADs—A和pBADs-BPP的双歧杆菌于AMP^-和AMP^＋的MRS培养液中。厌氧培养后,将样品涂布于AMP^＋的MRS固体培养板上计数菌落数。结果相同条件下质粒pBADs·BPP组菌落数高于质粒pBADs—A组（P〈0．05）。结论BPP可以增加质粒载体的稳定性。     

miR-92a-3p和miR-25-3p海绵上调Kiss1并影响雌性小鼠的青春期启动及动情周期

下丘脑Kiss1神经元产生的神经肽kisspeptin通过影响促性腺激素释放激素的分泌,参与青春期的启动、生殖系统的成熟以及排卵等过程的神经内分泌调节。Kiss1基因的表达受到包括多种反式调控因子及表观遗传的调控。预测与前期研究表明,miR-92a-3p、miR-25-3p的种子序列能够与Kiss1的3′-UTR直接结合,抑制Kiss1的表达。为进一步研究miR-92a-3p、miR-25-3p在Kiss1表达调控中的作用,本研究分别构建了对miR-92a-3p、miR-25-3p具有抑制作用的特异性吸附海绵载体：sponge-miR-92a和sponge-miR-25,以实现miRNA的功能缺失。流式细胞术和双荧光素酶报告基因系统分别证实,这2个海绵载体均能够非常有效地吸附外源性或内源性靶miRNA。sponge-miR-92a和sponge-miR-25载体被进一步包装成慢病毒LV-sponge-miR-92a和LV-sponge-miR-25。实时荧光定量PCR结果显示,经LV-sponge-miR-92a和LV-sponge-miR-25感染的下丘脑原代神经元细胞中,Kiss1表达水平均显著上调（P<0.05）;将LV-sponge-miR-92a注射到下丘脑后,雌性小鼠阴门开启时间明显提前（P<0.05）;下丘脑注射LV-sponge-miR-92a和LV-sponge-miR-25扰乱了雌性小鼠的正常动情周期。综上所述,成功构建了能够有效吸附miR-92a-3p、miR-25-3p的海绵载体,证明它们在解除miR-92a-3p、miR-25-3p对Kiss1的抑制中的作用,下丘脑注射海绵对雌性小鼠的阴门开启时间和动情周期均产生一定程度的影响,提示miR-92a-3p、miR-25-3p可能在青春期的启动和生殖成熟过程中发挥重要的作用。     

利用基于CRISPR-Cas9 的基因编辑技术对miR-29a在GT1-7 细胞中进 行基因敲除

目的:本文利用CRISPR-Cas9技术在GT1-7细胞中对miR-29a基因进行基因编辑,用于构建miR-29a基因敲除GT1-7细胞模型。方法:通过构建Cas9稳转的GT1-7细胞株并转染sgRNA质粒用于在靶向miR-29a基因区域引发突变。然后构建EGFP与sgRNA共表达质粒并转染Cas9稳转GT1-7细胞,利用流式细胞仪富集表达绿色荧光蛋白的阳性细胞和分选阳性单克隆细胞。最后利用实时荧光定量PCR(realtimefluorescencequantitativePCR)对富集细胞和单克隆细胞进行miR-29a表达量检测。结果:T7E1检测结果显示CRISPR-Cas9系统有效地在miR-29a基因区域引发了突变。荧光定量PCR结果显示,与对照组相比,富集后阳性细胞miR-29a的表达量整体下降了50%左右(P0.05)。此外,通过流式筛选获得了一个纯合miR-29a基因敲除细胞克隆,与对照组相比,其miR-29a的表达量下降了75%左右(P0.05)。结论:本文建立了一种有效编辑GT1-7细胞基因的方法,并采用该方法构建了miR-29a稳定敲除细胞模型。     

双歧杆菌的完整肽聚糖对巨噬细胞AP-1的影响

目的探索信号途径ERK→AP-1在双歧杆菌的完整肽聚糖(WPG)激活巨噬细胞中的作用。方法以WPG刺激SD大鼠腹腔巨噬细胞,采用凝胶电泳迁移分析技术检测巨噬细胞AP-1的活性。结果WPG刺激组巨噬细胞AP-1的活性明显高于对照组(P<0.01);巨噬细胞经ERK抑制剂PD98059预孵后,其AP-1的活性显著低于WPG刺激组(P<0.01)。结论双歧杆菌的WPG可通过ERK→AP-1这一信号途径来活化巨噬细胞。     

花蜜微生物及其生态功能研究进展

花蜜是虫媒植物提供给传粉者最有效的报酬,对花蜜特征介导的植物-传粉者相互关系的研究已成为当今传粉生物学研究中最活跃的领域之一。开花植物分泌的原始花蜜是无菌的,不过一些微生物可经由空气传播至花蜜或(和)通过与传粉者的喙接触而聚集于花蜜中,并利用花蜜中的营养物质进行快速繁殖。花蜜的高渗透压环境导致花蜜中微生物(酵母菌,细菌)的物种多样性相对较低。此外,某些生物(传粉者组成,微生物间的竞争)与非生物因素(渗透压,糖组成,次生代谢物质,抗菌化合物,可利用氮源,温度,pH)也可影响花蜜中微生物群落的形成。花蜜中微生物的代谢活动能够改变花蜜物理(温度,粘度)与化学(pH,H_2O_2含量,糖组成和浓度,氨基酸组分和浓度,以及气味)特性,进而影响传粉者的访花行为与植物的繁殖适合度。因而,对花蜜中微生物及其生态功能的研究近年来颇受传粉生物学家的关注。在总结已发表研究成果的基础上,提出今后的研究有必要结合分子生物学与化学分析技术,以进一步揭示影响花蜜中微生物群落的潜在因素的作用机制,同时对花蜜微生物改变花蜜的物理、化学特性及植物-传粉者之间相互作用的可能原因进行更详尽的阐释,特别是对花蜜微生物在生态系统中所发挥的生态功能进行进一步的研究与认识。     

二代测序应用于检测GT1-7细胞中KISS1和GnRH启动子的DNA甲基化状态的研究

目的:利用二代测序技术检测GT1-7细胞中KISS1和GnRH基因启动子范围内的甲基化状态,并用金标准的亚硫酸氢盐修饰后的克隆测序作为对照,比较二代测序与金标准克隆测序在研究DNA甲基化检测中的差别。方法:提取GT1-7细胞基因组DNA并进行亚硫酸氢盐处理。进行巢式PCR,将PCR产物进行二代测序。同时采用金标准的亚硫酸氢盐修饰后克隆测序的方法作为对照,对相同批次的PCR产物进行克隆测序。结果:PCR产物二代测序结果表明KISS1和GnRH两个基因的27个CpG甲基化位点信息完整,结果准确。挑取10个克隆进行一代测序结果表明序列无丢失,KISS1和GnRH两个基因的27个CpG甲基化位点信息完整。结论:利用高通量的二代测序技术能够有效的对DNA甲基化的PCR产物进行检测,二代测序和克隆测序都是研究DNA甲基化的有效方法,但前者与克隆测序相比每一个读取序列(reads)都相当于一个单克隆,且二代测序每个区段得到成百上千个reads,因此二代测序结果更加精确。     

基于荧光通用引物的多重定量RT-PCR基因表达谱分析平台的构建、优化及其应用

文章建立并优化了一种基于荧光通用引物的多重定量RT-PCR技术, 该技术采用了嵌合特异引物引导荧光通用引物的扩增方案, 多个目的基因被一对通用引物等比例扩增, 从而实现多重定量检测。该技术实现了经济可靠的中通量基因表达定量研究, 弥补了基因表达分析平台中cDNA芯片定量准确性低和Real-time quanti-tative PCR通量小的缺点, 完善了整个基因表达的分析过程。文章以小鼠X染色体上影响性发育启动的QTL区段为例, 选择11个目的基因进行了技术构建及优化, 确定了该技术的检测灵敏度为102拷贝, 通用引物与上游嵌合特异引物的比例以1:1为佳, 并且验证了该技术的重复性和准确性。降落式(Touchdown)PCR结合通用引物补加实验表明, 该优化步骤可大大改善低丰度表达基因的扩增。通过对2个品系(C3H/HeJ和C57BL/6J)15日龄小鼠的下丘脑和睾丸组织中的11个基因的表达分析, 在下丘脑中找到了一个差异表达的基因PHF6可用于进一步的基因功能研究。