3种假单胞菌CaCl2法感受态细胞制备及转化条件

假单胞菌因其生境和代谢类型的多样性,在污染环境修复、生物转化、生物防治等领域具有广阔的应用潜力;外源基因的导入是假单胞菌遗传改造的重要环节,而感受态细胞的制备和转化方法的建立是导入外源基因的重要方法学基础.本研究以从石油污染土壤中分离筛选的假单胞菌属的3个菌株Pseudomonas putida TS11、P. stutzeri DNB、P. mendocina JJ12为对象,通过3因素4水平正交实验设计,研究了不同CaCl₂浓度、热激时间及复苏时间对不同假单胞菌感受态细胞制备及转化效率的影响.结果表明： CaCl₂浓度是影响假单胞菌转化效率的最主要因素(P<0.05),且在制备感受态细胞之前用无菌蒸馏水多次洗涤菌体细胞,转化率明显提高.3种假单胞菌的CaCl₂转化优化条件分别为：100 mmol·L^-1 CaCl₂,热激3 min,复苏1.5 h;50 mmol·L^-1 CaCl₂,热激6 min,复苏1.5 h;75 mmol·L^-1 CaCl₂,热激4.5 min,复苏0.5 h.在上述转化条件下,3种假单胞菌的外源质粒转化效率均达到10.5个转化子·μg^-1 DNA水平.     

大肠杆菌JM109感受态形成因素分析

目的:分析大肠杆菌JM109感受态形成因素,提高转化效率。方法:采用不同生长状态、不同转化溶液、不同保存时间及热激处理时间的细菌制备感受态,分析转化效率。结果:以20mmol/L MgCl2 80mmol/L CaCl2为处理液,经活化培养OD600为0.82的菌液制备感受态细胞,4℃放置12~24h之内,42℃热激处理60s,转化效率最高,可达9.8×106~1.2×107cfu/μg DNA(pUC19)。随着质粒长度增加,转化效率下降。结论:感受态细胞形成与生长状态关系密切,金属离子、有机溶剂对感受态的形成影响显著。感受态形成过程中,细胞可能发生了一系列的生理变化。     

用多寄主质粒pSUP1O6转化荧光假单胞菌Pfx-18

构建了荧光假单胞菌工程菌的转化系统,探索了多寄主质粒pSUP 106在不同CaCl_2浓度、不同热激时间和荧光假单胞菌受体在不同生长期的转化频率,建立了一个简便可行的荧光假单胞菌转化方法.结果表明,在荧光假单胞菌Pfx-18生长到0 D_(600)≈0.55时,用25mmol/L CaCl_2处理细胞,热激2min,转化频率最高,可达10~5/ng DNA.同时讨论了Mn~(2+)和Mg~(2+)对转化频率的影响,以及电转化的效果,为进一步利用该转化系统进行异源基因的克隆与表达研究奠定了基础.     

高效、快速地将外源DNA导人根癌土壤杆菌

室温下用50mmol/L CaCl₂处理根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)以制备感受态细胞．然后经O℃冰浴及28℃热击处理,成功地将Ti质粒中间载体(>10kb)导入了根癌土壤农杆菌中。转化效率每个活细胞可达10 -4～10 -5转化子或10 6转化子／μgDNA。探讨了该菌细胞生长状态、CaCl2溶液浓度、温度、液氮、热击、复苏时间以及感受态细胞于4℃或-20℃(加15％甘油)下保存时间对根癌土壤杆菌转化的影响。     

质粒pMC71A—LEU转化阴沟肠杆菌E26—1的研究

质粒pMC71A－LEU在对阴沟肠杆菌E26－1（EnterobactercloacaeE26－1）的转化中研究了感受态细胞、CaCl2浓度、热激温度和质粒DNA量对转化频率的影响。结果表明,在阴沟肠杆菌F26－1生长到OD600＝0．45时,用50mmol／LCaCl2处理细胞,加入100ng质粒DNA,在32℃热激2min,转化频率最高,可达1×103转化子／μgDNA。     

高效、快速地将外源DNA导入根癌土壤杆菌

室温下用50mmol/LCaCl_2处理根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)以制备感受态细胞,然后经0℃冰浴及28℃热击处理,成功地将Ti质粒中间载体(>10kb)导入了根癌土壤农杆菌中。转化效率每个活细胞可达10~(-4)～10~(-5)转化子或10~6转化子/μgDNA。探讨了该菌细胞生长状态、CaCl_2滚滚浓度、温度、液氮、热击、复苏时间以及感受态细胞于4℃或—20℃(加15％甘油)下保存时间对根癌土壤杆菌转化的影响。     

制备高效大肠杆菌电转化感受态细胞和电转化条件的研究

旨在建立一种高效大肠杆菌电转化感受态细胞的制备方法,研究了摇瓶装液量,菌体生长阶段,转化电场强度,转化后复苏时间以及感受态细胞存放时间等对转化效率的影响.结果表明,基液量为400 mL/2L,菌体在OD600值为0.452时收集所制备的感受态细胞,在电场强度12.5 kV/cm条件下电击5 ms,转化后复苏时间2h,转化效率可达到1010CFU/μg DNA.此条件下制备的感受态细胞转化效率高,质量稳定,重复性好.     

外源质粒电击转入Pseudomonas putida的条件研究

以自行筛选的恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）(命名为Rs198,Genbank登录号为FJ788425）为受体菌,将具有卡那霉素抗性标记的大肠杆菌假单胞菌穿梭质粒PDSK519通过电转化法导入到受体菌中,对细胞生长状态、电转化温度、质粒DNA及感受态细胞浓度、电击电压及电转化介质给予转化效率的影响进行研究。结果表明,在细胞生长至OD600为0.5左右时收集菌体,在低温条件下制备浓度为 4.6×1012/ml 的感受态细胞,以0.3mol/L的蔗糖为电转化介质,在13kV/cm的场强下电击能获得较高的转化效率,最高可达1.3×107个转化子/μ g DNA。为构建恶臭假单胞的遗传转化系统,利用基因工程手段为该菌的进一步研究奠定了理论基础。     

双歧杆菌感受态细胞的制备和电转化条件的研究

介绍目前常用的双歧杆菌感受态细胞制备方法,并系统研究影响双歧杆菌电转化效率的关键因素。通过研究,菌体在4oo为0.3-0. 5时收集以制备感受态细胞,制备好的感受态细胞应尽早用于电转化;最佳电场强度为12.5 kV/cm;转化后的细胞复苏培养2 h为佳。感受态细胞的转化效率可达103 CFU/μg DNA。     

一种快速简便的CaCl2质粒转化方法

介绍一种质粒DNA快速转化方法.质粒DNA加入感受态细胞,冰浴3～10min,涂布预热至37℃的平板,即可获得与常规转化方法相当的转化效率.操作步骤由5步减至2步,时间由2h减至3～10min.同时探讨了Ca2 浓度、4℃保存时间等因素对感受态细胞转化效率的影响     

Determination of stoichiometry of radioiodination of proteins

A sensitive method for the detection of small quantities of hydrophobic antioxidant free radical scavengers such as butylatedhydroxytoluene (BHT) and butylatedhydroxyanisole (BHA) in aqueous samples is described. The procedure involves extraction of the hydrophobic free radical scavenger into an organic solvent phase, followed by the subsequent reaction of an aliquot of this extract with the stable cation radical tris(p-bromophenyl)amminium hexachloroantimonate (TBACA). In experiments with BHT and BHA, the loss of TBACA absorbance at 730 nm was found to be linearly proportional to the amount of antioxidant added, with quantities of BHT as small as 200 pmol being easily detectable. In aqueous suspensions of dimyristoylphosphatidylcholine vesicles, assays of the aqueous BHT concentration showed that BHT partitioned strongly into the membrane phase, achieving very high BHT/phospholipid ratios. For a given concentration of BHT, partitioning into the membrane phase was greater in large, multilamellar liposomes than in either small, single-walled vesicles or in purified rat brain synaptic vesicle membranes. Direct assay of BHT and BHA in phospholipid membranes, however, was complicated by a nonspecific interaction between TBACA and the phospholipid.     

六种藓类植物茎的比较解剖学研究

通过对6种藓类植物,即褶叶青藓(Brachythecium salebrosum(Web.et Mohr.)B.S.G.)、湿地匐灯藓(Plagiomnium acutum(Lindb.)Kop.)、侧枝匐灯藓(Plagiomnium maximoviczii(Lindb.)Kop.)、大凤尾藓(Fissidensnobilis Griff.)、大羽藓(Thuidium cymbifolium(Doz.et Molk.)B.S.G.)和大灰藓(Hypnum plumaeforme Wils.)嫩茎和老茎的石蜡切片和显微观察发现,同一藓类植株的嫩茎和老茎,茎结构稳定,不同种藓类植物茎横切面具有不同特征.植物体茎横切面形状、表层细胞的层数、细胞大小和细胞壁厚薄、皮层细胞大小和形状、中轴的有无以及比例等特征可以作为藓类植物的分科分类依据之一.