新型重组糖蛋白表达载体--盘基网柄菌

近年来,盘基网柄菌作为异源重组糖蛋白表达载体的研究受到了学术界的重视,已经有多种具有生物活性的复杂糖蛋白成功地得到了表达。通过对表达产物的研究发现,盘基网柄菌具有各种翻译后加工机制,例如磷酸化、酰基化及形成GPI(糖基磷脂酰基醇)锚点等,具有类似于高等动物的糖基化修饰能力。与哺乳动物细胞表达载体相比较,盘基网柄菌具有培养成本低廉、细胞生长迅速及易于大规模培养的优势。盘基网柄菌有可能发展成为一种有重要应用前景的糖蛋白表达载体系统。     

酿酒酵母代谢工程技术

自20世纪90年代初期诞生以来,代谢工程历经了30年的快速发展。作为代谢工程的首选底盘细胞之一,酿酒酵母细胞工厂已被广泛应用于大量大宗化学品和新型高附加值生物活性物质的生物制造,在能源、医药和环境等领域取得了巨大的突破。近年来,合成生物学、生物信息学以及机器学习等相关技术也极大地促进了代谢工程的技术发展和应用。文中回顾了近30年来酿酒酵母代谢工程重要的技术发展,首先总结了经典代谢工程的常用方法和策略,以及在此基础上发展而来的系统代谢工程和合成生物学驱动的代谢工程技术。最后结合最新技术发展趋势,展望了未来酿酒酵母代谢工程发展的新方向。     

无细胞蛋白质合成系统的研究进展

无细胞蛋白质合成系统是一种以外源mRNA或DNA为模板 ,通过在细胞抽提物的酶系中补充底物和能源物质来合成蛋白质的体外系统 .与传统的体内重组表达系统相比 ,体外无细胞合成系统具有多种优点 ,如可表达对细胞有毒害作用或含有非天然氨基酸 (如D 氨基酸 )的特殊蛋白质 ,能够直接以PCR产物作为模板同时平行合成多种蛋白质 ,开展高通量药物筛选和蛋白质组学的研究等 .本文综述了无细胞蛋白质合成系统的发展历史、系统中合成蛋白质所需的能量供应、遗传模板的稳定性和微型无细胞生物反应器等多方面的研究 ,并探讨了无细胞蛋白质合成系统中存在的难点、研究方向和广泛的应用前景     

制备高效大肠杆菌电转化感受态细胞和电转化条件的研究

旨在建立一种高效大肠杆菌电转化感受态细胞的制备方法,研究了摇瓶装液量,菌体生长阶段,转化电场强度,转化后复苏时间以及感受态细胞存放时间等对转化效率的影响.结果表明,基液量为400 mL/2L,菌体在OD600值为0.452时收集所制备的感受态细胞,在电场强度12.5 kV/cm条件下电击5 ms,转化后复苏时间2h,转化效率可达到1010CFU/μg DNA.此条件下制备的感受态细胞转化效率高,质量稳定,重复性好.     

利用盘基网柄菌表达可溶性人Fas配体

用PCR扩增从激活的人中性粒细胞中得到的编码可溶性Fas配体胞外区中第141个到第281个氨基酸的cDNA ,将其与hCG-β信号肽片段融合到质粒MB12neo中,随后导入到盘基网柄菌AX3细胞中,得到分泌性表达hFasL的重组菌AX3-H3。为提高shFasL的表达量,对质粒pMB12neo作了改造,得到衍生质粒pMB74。利用质粒pMB74克隆表达shFasL ,得到高通量表达shFasL的重组菌AX3_pLu8。在复杂培养基HL_5C中,重组菌的细胞密度可达(1.5～2 )×10⁷ mL ,AX3-H3及AX3_pLu8分泌的shFasL浓度分别为23.5 μg/L及206μg/L。利用合成培养基SIH培养重组菌AX3-H3及AX3-pLu8,细胞密度均达到(4～5)×10⁷m/L ,shFasL浓度则分别达到111μg/L和420μg/L。     

豆血红蛋白在毕赤酵母中的表达条件优化

【背景】豆血红蛋白可赋予素肉制品类似牛肉的红褐色质地,已被美国食品药物监督管理局批准作为人造素肉的着色剂,近年来受到广泛关注。【目的】优化毕赤酵母产豆血红蛋白的培养条件,提高毕赤酵母产豆血红蛋白的产量。【方法】首先通过单因素试验研究蛋白胨种类、大豆蛋白胨浓度、铁盐种类及血红素浓度在诱导阶段对毕赤酵母产豆血红蛋白的影响;然后通过Plackett-Burman试验设计筛选出对豆血红蛋白产量影响最大的3个因素,再通过最陡爬坡法确定3个因素的变化范围,对3个因素进行响应面分析;最后根据响应面结果进行摇瓶发酵和发酵罐高密度发酵。【结果】单因素试验发现：用4%大豆蛋白胨作为主要氮源、甲醇诱导浓度为1.5%、血红素浓度为5μmol/L时发酵效果较好,经过响应面优化后得到蛋白胨浓度为51.48 g/L、pH 5.66、培养基装液量35.84mL/250mL是最优发酵条件。在此优化条件下,LegH摇瓶发酵产量为0.191 mg/mL,与预测值(0.183 mg/mL)比较接近。采用5 L发酵罐进行高密度发酵,LegH产量最高达到0.384 mg/mL。【结论】优化了毕赤酵母表达豆血红蛋白的发酵条件,获得...     

聚氨酯泡沫半固定化培养盘基网柄菌

研究了聚氨酯泡沫应用于固定化盘基网柄菌的可行性,发现以简单处理过的聚氨酯泡沫为载体,能够高效实现盘基网柄菌的固定化培养。考察了载体粒径大小、载体量和摇床转速等对固定化培养的影响,在优化的培养条件和固定化条件下,盘基网柄菌的最大细胞密度是悬浮培养的2~4倍。     

毕赤酵母基因编辑技术研究进展

巴斯德毕赤酵母是一种重要的蛋白表达系统,基因编辑技术作为代谢工程的基本工具,对于毕赤酵母的代谢改造十分重要。近十年基因编辑技术发展迅速,除传统的同源重组和Cre/loxP重组外,相继出现了许多新的基因编辑技术,例如ZFN、TALEN和CRISPR/Cas9等,这些技术的出现使基因编辑更加简便高效。本文对毕赤酵母中传统和新型基因编辑技术的原理应用和研究进展进行了简要综述,并结合相关领域的发展对毕赤酵母基因编辑技术的发展进行了展望。