人源抗狂犬病病毒单克隆抗体的构建及验证

目的利用人源抗狂犬病病毒ScFv噬菌体抗体库,构建单克隆抗体(单抗)轻、重链质粒,瞬时表达,纯化后验证具有高中和活性的单抗。方法以从ScFv噬菌体抗体库中筛选获得特异性抗体为模板,PCR扩增抗体轻、重链可变区序列,构建人源全分子抗体瞬时转染质粒;轻、重链质粒混合后转染HEK293 EBNA1细胞,瞬时表达全分子抗体。采用Mabselect SuRe介质手动亲和纯化抗体,Nano Vue超微量分光光度计测定蛋白质的质量浓度,快速荧光灶抑制试验(rapid fluorescent focus inhibition test, RFFIT)进行体外中和效价验证。结果成功构建22个轻链质粒,15个重链质粒。通过真核细胞瞬时表达后,经手动亲和纯化后,获得22株单抗。除1株抗体外,其余21株抗体的蛋白质量浓度均>300μg/mL;部分抗体纯度均在90%以上。中和活性结果显示,5株在1 500~1 800 IU/mg之间;8株在800~1 500 IU/mg之间;7株在500~800 IU/mg之间;其余2株在500 IU/mg以下。结论成功构建并验证获得20株中和活性>500 IU/mg的人源抗狂犬病病毒单抗,为单抗混合制剂的研究奠定了基础。     

一种从抗狂犬病病毒噬菌体抗体库中筛选和验证中和抗体的方法

目的建立一种从噬菌体库抗体库中高效筛选和验证抗狂犬病病毒中和抗体的方法。方法①定性分析:从经过灭活的CVS-11筛选噬菌体抗体库中挑取单克隆于96孔板中培养,制备噬菌体抗体,取培养上清进行快速荧光灶抑制试验(rapid fluorescent focus inhibition test, RFFIT),选择可明显抑制病毒感染的克隆测序,获得具有中和活性的抗体可变区序列;②定量分析:挑选有中和活性的克隆,重新制备噬菌体抗体颗粒,纯化后进行RFFIT分析;扩增抗体可变区基因,构建真核瞬时表达质粒。瞬转HEK-293 EBNA1细胞,培养上清经Mabselect SuRe亲和纯化后测定抗体比活。结果定性分析获得的噬菌体抗体颗粒与全分子抗体体外中和活性显著相关;剔除低活性序列后,活性高于0.5 IU/mL的噬菌体抗体颗粒与其全分子抗体体外中和活性之间无显著相关;所有纯化后噬菌体抗体颗粒活性>0.5 IU/mL的序列其全分子抗体体外中和活性均>500 IU/mg。结论构建了一种从抗狂犬病病毒噬菌体库中高效筛选、验证中和抗体的方法。     

人源中和性抗狂犬病毒基因工程抗体的研制

从具有高滴度狂犬病毒抗体的多位疫苗注射者采集外周血淋巴细胞,构建人源抗狂犬病毒Fab基因工程抗体文库。用纯化的狂犬aG和CTN株病毒颗粒富集筛选所得Fab噬菌体抗体文库,利用ELISA和间接免疫荧光法IFA鉴定所得人源单克隆抗体Fab段基因的功能特性,并通过序列测定确定所得抗体的轻链和重链的型别,成功获得11株抗狂犬病毒糖蛋白的人源单克隆Fab抗体。将其中5株人源单克隆Fab抗体的轻链和重链分别克隆入全抗体表达载体pAC-L-Fc后转染昆虫Sf9细胞,利用杆状病毒系统实现全抗体的分泌型表达。5株全抗体在体外与狂犬病毒CVS-11株的中和反应中均显示具有狂犬病毒中和活性。人源中和性抗狂犬病毒基因工程全抗体的获得为我国自行生产抗狂犬病单克隆抗体鸡尾酒奠定了物质基础。     

狂犬病病毒抗体胶体金检测试纸的制备

通过胶体金免疫层析技术建立一种特异、便捷、快速的狂犬病病毒抗体检测方法,对犬等动物免疫狂犬病疫苗后的抗体水平监测提供参考。用醋酸锌沉淀法沉淀狂犬病病毒CVS11,Sepharose 4FF进行层析纯化。用柠檬酸三钠还原法制备的胶体金,标记纯化的狂犬病病毒,喷于试纸的结合释放垫 (金标垫),将SPA (葡萄球菌表面A蛋白) 和纯化的兔抗狂犬病病毒IgG分别喷于试纸的T (检测线) 处和C (对照线) 处,组装试纸条。用制备的试纸条对261份犬血清进行检测,与快速荧光灶抑制试验 (RFFIT) 检测的结果一致;对已知效价的犬狂犬病毒中和抗体 (VNA) 大于0.5 IU,结果为阳性;对狂犬病病毒中和抗体 (VNA) 小于0.5 IU/mL的血清,结果为阴性。制备的狂犬病病毒抗体胶体金检测试纸检测犬血清抗体,具有特异、便捷、快速的特点,能够检测出狂犬病病毒中和抗体大于0.5 IU的血清,适用于临床犬血清抗体水平监测,具有良好的应用前景。     

不同狂犬病毒株抗原反应性的比较研究

应用ELISA法对285份免疫前及健康人血清和742份以不同毒株制备的狂犬病疫苗(aG株、CaG株、CTN株,PM株)全程免疫后人群的血清标本进行抗狂犬病毒抗体的检测。结果显示CTN株病毒抗原对不同毒株狂犬病疫苗免疫后血清的抗体阳性检出率均能达到90％以上,且与SNT效价的相关性较好;而aG株抗原对除aG株以外其它毒株狂犬病疫苗免疫后血清的阳性检出率仅为50％左右。因此不同毒株狂犬病毒抗原的反应性存在明显差异,选用纯度高、活性好的CTN株病毒或两株病毒以不同比例混合作为ELISA检测用抗原,测定疫苗免疫后人群的抗体水平,可获得满意的结果。     

狂犬病病毒M蛋白在杆状病毒中的表达、纯化及多克隆抗体的制备

为表达狂犬病病毒(Rabies Virus,RV)基质蛋白(M)蛋白,进而制备多克隆抗体。本研究以狂犬病病毒BD06株RNA为模版,通过RT-PCR扩增M蛋白基因全序列,将其插入质粒pFastbac I中,获取的重组质粒pFastbac I-M,经酶切鉴定后,转化到DH10Bac E.coli感受态中,以获取重组穿梭质粒Bacmid-M。用lipofectamine2000介导Bacmid-M转染Sf9细胞获取重组杆状病毒AcMNPV-M。用抗His标签的单体、犬抗RV阳性血清及兔抗RV阳性血清通过Western-Blot鉴定重组蛋白的表达及其反应原性。用镍离子亲和层析柱纯化重组蛋白,并免疫新西兰大耳白兔制备多克隆抗体,用Western-Blot和FAVN试验鉴定多克隆抗体的反应原性及其病毒中和效价。结果表明:(1)利用杆状病毒表达系统成功的表达了大小约为25kD的重组M蛋白;(2)重组M蛋白具有良好的免疫原性和反应原性;(3)制备的多克隆抗体与狂犬病病毒BD06、SRV 9、CVS-24、ERA、PV 2061及aG株的M蛋白均能发生特异性反应,但其无病毒中和能力。本研究完成了重组M蛋白的表达、纯化并制备了其多克隆抗体,为进一步研究M蛋白的生物学功能奠定了物质基础。     

家养犬、猫及野生动物中狂犬病病毒流行病学调查及我国不同类型狂犬病疫苗免疫效果观测研究

选择我国狂犬病高发地区(湖南、贵州)、低发地区(江苏、武汉)和无狂犬病报告地区(沈阳)等三种不同类型的地区,开展针对家养犬、猫和啮齿类动物,以及蝙蝠等野生动物的狂犬病病毒带毒率的流行病学调查,对分离到的病毒株在抗原型别、基因变异以及与现行疫苗是否匹配等方面进行分析、比较研究。结果显示:我国狂犬病的主要宿主动物为犬,捕获犬总带毒率为2.56%;犬中狂犬病病毒的监测点最高阳性检出率达到20.0%;啮齿类动物及蝙蝠等野生动物在本次研究未检测到狂犬病病毒。我国自主研制成功的以aG株和CTN株为毒种的现行人用狂犬病疫苗,经应用研究发现,CTN株的糖蛋白基因与本研究分离到的街毒核酸序列更接近。为进一步评价现行疫苗的有效性,在5个观察点分别以aG株和CTN株毒种生产的疫苗接种两组人群(每组各约50人),结果显示均未出现中、强度反应,疫苗免疫后第7d和14d产生的中和抗体分别达到0.49IU/mL~0.52IU/mL和6.7IU/mL~7.53IU/mL;抗体阳转率分别为45.1%~47.9%和100%,表明这些疫苗具有良好的安全性和保护效果。     

人源抗狂犬病毒中和性全抗体在昆虫细胞中的表达

将来源于噬菌体抗体库的人源狂犬病毒糖蛋白特异性单抗G10Fab的基因 ,克隆入杆状病毒人源IgG抗体表达载体 ,通过转染将重组质粒导入昆虫细胞 ,以全抗体的形式表达了一株人源抗狂犬病毒基因工程抗体G10。用亲和层析的方法纯化了表达产物 ,经与一株鼠源糖蛋白特异性单抗竞争证实 ,该单克隆抗体特异性识别狂犬病毒糖蛋白 ,亲和力约为 10 -9M。体外中和实验证明 ,该单抗对狂犬病毒aG株具有体外中和活性     

重组抗狂犬病病毒抗体在HEK293 EBNA1细胞中的瞬时表达优化

目的:优化重组抗体在悬浮无血清培养的HEK293 EBNA1瞬时表达,提高重组抗体表达量。方法:将HEK293 EBNA1细胞适应于无血清悬浮培养,筛选适宜的无血清培养基。使用PEI转染质粒进入细胞,瞬时表达重组抗体;使用Modde软件进行实验设计(DOE),优化转染质粒量、轻重链比例、PEI量等影响瞬时表达的条件。培养上清经亲和纯化,获得目标抗体,用快速免疫荧光灶抑制试验(RFFIT)测定抗体活性,用BCA法测定纯化抗体浓度。结果:293SFMII为适宜的HEK293 EBNA1细胞无血清悬浮培养基。对抗体表达影响最大的因素是轻重链比例(P=0.00000),其次为质粒浓度(P=0.00086),最后为PEI(P=0.00257)。优化的转染条件为:质粒用量0.61μg/106细胞,轻重链比例2:1,PEI 2.67μg/106细胞,优化后抗体表达量有显著提高(P=0.007)。结论:通过DOE优化获得了重组抗狂犬病病毒抗体的高水平表达,抗体表达量提高了至少50倍。     

人源抗狂犬病毒中和性全抗体在昆明细胞中的表达

将来源于噬菌体抗体库的人源狂犬病毒糖蛋白特性异特单抗G10Fab基因的,克隆入杆状病毒人源IgG抗体表达载体,通过转染将重组质粒导入昆虫细胞,以全抗体的形式表达了一株人源抗狂犬病毒基因工程抗体R10。用亲和层析的方法纯化了表达产物,经过一株鼠源糖蛋白特异性单抗竞争证实,该单克隆抗体特异性识别狂犬病毒糖蛋白,亲和力约为10^-9M.体外中和实验证明,该单抗对狂犬病毒aG株具有体外中和活性。     

低pH孵放病毒灭活处理对马破伤风免疫球蛋白F(ab')_2质量的影响

目的考察低pH孵放病毒灭活处理对马破伤风免疫球蛋白F(ab')_2质量的影响。方法取马破伤风免疫球蛋白F(ab')_24份,分别调整pH至3.8、4.1、4.4及6.5,于(25±1)℃条件下放置21 d后取样测定抗体效价、聚合物(二聚体、多聚体)及F(ab')_2含量,评估低pH孵放病毒灭活法对上述质量指标的影响;以1 mL/瓶的规格分装经低pH孵放病毒灭活处理的马破伤风免疫球蛋白F(ab')_2,于(25±1)℃条件下存放6个月,定期取样并进行抗体效价、聚合物(二聚体、多聚体)及F(ab')_2含量检测,评估其稳定性。结果马破伤风免疫球蛋白F(ab')_2经低pH孵放病毒灭活后,其抗体效价、聚合物(二聚体、多聚体)及F(ab')_2含量未发生明显变化;样品于(25±1)℃条件下存放6个月后,抗体效价和F(ab')_2含量均符合《中华人民共和国药典》2015版(三部)的要求。结论低pH孵放病毒灭活法适用于马破伤风免疫球蛋白F(ab')_2病毒的灭活。     

不同酸水解酪蛋白对W135群和Y群脑膜炎奈瑟菌荚膜多糖产量的影响

目的 探索不同酸水解酪蛋白对W135群与Y群脑膜炎奈瑟菌(脑膜炎球菌)荚膜多糖产量的影响。方法 分别以NaCl质量分数为37%和14%的酸水解酪蛋白作为有机氮源配制改良半综合高盐培养基和低盐培养基,利用全自动细菌发酵罐分别在两种培养基里培养W135群和Y群脑膜炎球菌,比较这两种菌株在两种培养基中的生长时间、收获液菌密度( A 600 nm 值)、收获液去菌体后与去复合多糖后上清中的荚膜多糖含量,以及纯化后的精糖产量;比较高盐培养基收获液及其2倍稀释液中不同终含量的十六烷基三甲基溴化铵(cetyltrimethylammonium bromide, CTAB)溶液对多糖沉淀效果的影响。结果 W135群与Y群脑膜炎球菌在两种培养基中的培养时间差异无统计学意义( P >0.05),但高盐培养基收获液的菌密度、收获液去菌体后上清液中的多糖含量均高于低盐培养基收获液,差异有统计学意义( P < 0.05),而高盐培养基收获液纯化后的精糖产量低于低盐培养基,差异有统计学意义( P <0.05)。高盐培养液2倍稀释后,在CTAB终体积分数为0.04%时,W135群与Y群脑膜炎球菌多糖全部沉淀,而未稀释高盐培养液即使CTAB终体积分数提高到0.14%,依然也不能完全沉淀 W135群与Y群脑膜炎球菌多糖。结论 不同酸水解酪蛋白对W135群和Y群脑膜炎球菌的生长密度和荚膜多糖产量有影响,用CTAB溶液沉淀荚膜多糖时需控制收获液盐含量。     

变性梯度凝胶电泳在实验小鼠细菌检测中的应用

目的 研究变性梯度凝胶电泳(denatured gradient gel electrophoresis, DGGE)在实验小鼠细菌检测中的应用。方法 根据16S rDNA V3区引物,PCR扩增3种实验小鼠(KM小鼠、NIH小鼠和BALB/c小鼠)呼吸道和盲肠段的细菌基因组DNA;扩增产物运用DGGE进行电泳检测,并分析条带数量间差异的统计学意义。结果 KM小鼠盲肠段条带12~18条,呼吸道条带5~10条;NIH小鼠盲肠段条带15~20条,呼吸道条带4~10条;BALB/c小鼠盲肠段条带10~15条,呼吸道条带0~7条。统计分析结果显示,KM小鼠和NIH小鼠在盲肠和呼吸道电泳条带数量上的差异无统计学意义( P >0.05);BALB/c小鼠与KM小鼠、NIH小鼠间的差异均有统计学意义( P <0.05)。结论 DGGE 在实验小鼠盲肠和呼吸道细菌检测中能较好地反映菌群的物种多样性。     

细菌内毒素对A群C群脑膜炎奈瑟菌荚膜多糖蛋白质含量测定结果的影响

目的 探究Lowry法测定A群C群脑膜炎奈瑟菌(简称脑膜炎球菌)多糖原液蛋白质含量时,细菌内毒素对Lowry法的干扰情况。方法 根据《中华人民共和国药典》2015版(三部)规定的方法,测定含不同浓度的细菌内毒素的A群C群脑膜炎球菌多糖原液的蛋白质含量,对检测结果进行分析。以细菌内毒素为干扰物质,设计3种方法进行验证,对验证结果进行离散系数,即CV值分析,确定干扰限值。结果 当细菌内毒素含量较高时,A群C群脑膜炎球菌多糖原液的蛋白质含量明显增高,该结果可能为假阳性。验证试验结果显示,当溶液中细菌内毒素浓度达到0.313EU/mL时,会对检测结果产生干扰,浓度越高,干扰程度越高。结论 为获得准确的检测结果,当细菌内毒素浓度达到干扰限值时,应先消除干扰,再测定蛋白质含量。     

6A型肺炎球菌结合物分子大小对小鼠免疫原性的影响

目的 比较不同分子大小的6A型肺炎球菌(serotype 6A Streptococcus Pneumoniae )结合物和佐剂吸附在小鼠体内免疫原性的影响。方法 通过乙酸水解降低6A型荚膜多糖的相对分子质量制备成水解物,水解物经1-氰基-4-二甲胺基吡啶四氟硼酸盐(CDAP)活化并与破伤风类毒素己二酸酰肼衍生物TT AH 结合,制备成结合物。用Sepharose 4 Fast Flow 纯化结合物,并根据化学检测结果将结合物分为 K D 0.0~0.2、 K D 0.2~0.4、 K D 0.4~0.6等3个组分,每个组分分别以磷酸铝佐剂吸附,将吸附前后的各个组分按照每针次每只小鼠0.2 μg分别免疫小鼠,并采用ELISA检测结合物在小鼠体内的抗体水平。结果 3种不同相对分子质量吸附前后的结合物在小鼠体内均能产生较高水平的抗体,各组2、3针之间具有明显的加强效应。在吸附组和未吸附组中,3种不同分子大小的结合物在小鼠体内产生抗体水平无明显差异。各组分佐剂吸附后的结合物血清抗体滴度高于未吸附组,但这种差异无统计学意义( P > 0.05)。结论 结合物的分子大小对小鼠体内抗体水平的产生没有明显影响;磷酸铝佐剂吸附对于不同分子大小的结合物在小鼠体内的免疫原性有一定的增强效应,但这种增强效应差异无统计学意义。     

韭菜迟眼蕈蚊危害蚕豆根茎影响豌豆蚜的生长发育

地下害虫和地上害虫虽然在空间上隔离,但植物作为媒介将它们联系到一个系统,为了探讨地下害虫危害对地上害虫的影响,本文利用蚕豆植株作为媒介,研究了韭菜迟眼蕈蚊Bradysia odoriphaga Yang et Zhang危害蚕豆植株对两种色型豌豆蚜Acyrthosiphon pisum的影响。结果表明:韭菜迟眼蕈蚊危害改变了蚕豆植株的营养组成,包括干重和鲜重比、可溶性蛋白、可溶性糖、海藻糖和游离氨基酸。豌豆蚜取食后若虫历期延长,两种色型豌豆蚜1龄历期延长最为显著,红色型豌豆蚜3龄历期延长差异显著,其他各龄历期无差异;豌豆蚜若虫的死亡率提高,绿色型豌豆蚜1龄和2龄的死亡率高于对照组,红色型豌豆蚜2龄、3龄和4龄的死亡率高于对照组,其中红色型豌豆蚜2龄死亡率显著高于对照组;韭菜迟眼蕈蚊危害减小两种色型豌豆蚜每天产蚜数、10d累积产蚜数、净增值率、内禀增长率、周限增长率、相对生长率、体长和体重,平均世代周期延长但是无显著差异。结果表明,韭菜迟眼蕈蚊危害可直接影响蚕豆的营养组成,进一步间接影响豌豆蚜的生长发育。     

治疗脊髓损伤之建立星形胶质细胞模型的研究进展

脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)是一种极为复杂的破坏性疾病,一旦脊髓损伤发生,治疗棘手,对患者家庭、国家带来巨大的经济、社会负担。近年来,通过建立大鼠脊髓损伤细胞相关模型,对于脊髓损伤的病因病机治疗等方面有了进一步的认识,而星形胶质细胞模型的建立对脊髓损伤治疗有深远意义。研究发现,星形胶质细胞作为靶细胞通过血-脑脊液屏障直接或间接对脊髓损伤有双向调控作用。本文通过对近年来星形胶质细胞模型培养制备方案等研究进行总结,以期为建立一个客观化、定量化、可模拟化的星形胶质细胞模型提供指导对脊髓损伤的治疗提供新的思路。     

高原鼠兔干扰下高寒草甸植物功能群分布与土壤因子的关系

为阐明高原鼠兔干扰下高寒草甸植物功能群分布及其与土壤因子的关系,以高原鼠兔有效洞口密度代表其干扰强度,在青藏高原东缘高寒草甸选择3个不同干扰强度的高原鼠兔栖息区,调查植物群落结构和土壤理化性质,并分析高原鼠兔干扰下二者之间的关系.结果表明:(1)随高原鼠兔干扰强度增加,植物群落平均高度增加、盖度下降;(2)植物功能群多样性指数下降,其中莎草科和杂类草功能群多样性指数下降显著;(3)土壤有机质和全磷含量显著增加,土壤pH和土壤紧实度显著下降(P<0.05);(4)通过冗余分析和偏冗余分析,土壤化学因子(土壤全磷和全钾)的总效应和净效应达到极显著水平,表明高原鼠兔干扰下高寒草甸植物功能群分布与土壤全磷和全钾含量显著相关(P<0.05).     

肺炎链球菌C多糖含量检测方法的建立

目的使用肺炎链球菌C多糖单克隆抗体(单抗),建立检测荚膜多糖中残留的C多糖含量的方法。方法选择BALB/c雌性小鼠,采用体内诱生单抗腹水,放大生产肺炎链球菌C多糖单抗;使用间接ELISA、抑制性ELISA对其进行特异性鉴定;用特异性和亲和力高的单抗尝试建立肺炎链球菌荚膜多糖中C多糖含量检测的速率比浊法,并对该方法的线性、精密度、特异性进行验证。结果所制4株单抗的抗体类别均为IgM,识别的抗原表位互不相同,亲和力也不同。间接ELISA、抑制性ELISA结果均显示,所获得的单抗能够作用于肺炎链球菌C多糖上的磷酸胆碱位点,具有很好的特异性。选择单抗E8建立速率比浊检测方法的线性、精密度和特异性均良好,检测结果表明肺炎链球菌23个血清型荚膜多糖中C多糖含量不同。结论利用单抗建立了检测肺炎链球菌荚膜多糖中残留的C多糖的含量的速率比浊法。