盐及干旱胁迫对油菜抗氧化系统和RbohC、RbohF基因表达的影响

以白菜型油菜‘陇油6号’和‘天油2号’为试验材料,经MAPK抑制剂U0126、H_2O_2清除剂DMTU、NADPH氧化酶抑制剂DPI和IMD预处理后再分别进行盐胁迫、PEG-6000模拟干旱胁迫,研究其对两种油菜幼苗活性氧、抗氧化酶活性和RbohC、RbohF基因表达的影响.结果表明:盐胁迫和PEG-6000模拟干旱胁迫下,两种白菜型油菜中H_2O_2积累量上升,O_2^-·积累量下降,抗氧化酶(超氧化物歧化酶SOD、过氧化氢酶CAT、抗坏血酸过氧化物酶APX和谷胱甘肽还原酶GR)活性和RbohC、RbohF基因表达均升高.与单独胁迫处理相比,两种油菜O_2^-·积累、抗氧化酶活性和RbohC、RbohF基因的表达量均明显降低,经DMTU、DPI和IMD预处理后再分别进行盐和干旱胁迫,H_2O_2积累量下降,但U0126预处理后再进行胁迫处理,H_2O_2积累量上升.说明NADPH氧化酶、MAP激酶级联途径、H_2O_2参与了盐、干旱胁迫下活性氧产生、抗氧化酶活性变化和RbohC、RbohF基因表达的调控.     

盐及干旱胁迫对油菜抗氧化系统和RbohC、RbohF基因表达的影响

以白菜型油菜‘陇油6号’和‘天油2号’为试验材料,经MAPK抑制剂U0126、H₂O₂清除剂DMTU、NADPH氧化酶抑制剂DPI和IMD预处理后再分别进行盐胁迫、PEG-6000模拟干旱胁迫,研究其对两种油菜幼苗活性氧、抗氧化酶活性和RbohC、RbohF基因表达的影响.结果表明: 盐胁迫和PEG-6000模拟干旱胁迫下,两种白菜型油菜中H₂O₂积累量上升,O₂^-·积累量下降,抗氧化酶(超氧化物歧化酶SOD、过氧化氢酶CAT、抗坏血酸过氧化物酶APX和谷胱甘肽还原酶GR)活性和RbohC、RbohF基因表达均升高.与单独胁迫处理相比,两种油菜O₂^-·积累、抗氧化酶活性和RbohC、RbohF基因的表达量均明显降低,经DMTU、DPI和IMD预处理后再分别进行盐和干旱胁迫,H₂O₂积累量下降,但U0126预处理后再进行胁迫处理,H₂O₂积累量上升.说明NADPH氧化酶、MAP激酶级联途径、H₂O₂参与了盐、干旱胁迫下活性氧产生、抗氧化酶活性变化和RbohC、RbohF基因表达的调控.     

白菜型油菜RbohC和RbohF基因克隆与表达分析

该研究以白菜型油菜（Brassica rapa L.）‘陇油6号’为实验材料,采用RT PCR方法克隆油菜RbohC和RbohF基因,并采用实时荧光定量PCR技术对RbohC、RbohF基因在不同组织及非生物胁迫下的表达进行分析,为深入研究油菜RbohC、RbohF基因的生物学功能提供依据。结果显示：(1) 成功克隆得到2个全长分别为3 050 bp和2 995 bp的油菜RbohC (GenBank登录号：XM_009134386) 和RbohF (GenBank登录号：XM_009114548) 基因序列。(2) 生物信息学分析显示,油菜RbohC和RbohF基因开放阅读框（ORF）分别为2 733 bp和2 847 bp,编码910和948个氨基酸,推测二者的蛋白质分子量分别为103 kDa和108 kDa,理论等电点分别为9.47和9.21; 油菜RbohC、RbohF编码的氨基酸序列与萝卜等多种植物相应蛋白氨基酸序列具有较高的同源性,且这些序列高度保守并含有NADPH氧化酶的典型保守结构域,包括2个可以与Ca²⁺结合的EF手性模体结构、6个跨膜结构域、黄素腺嘌呤二核苷酸结合结构域、NAD焦磷酸结合结构域和C末端区域中的NADP核糖保守结合位点。(3) 油菜RbohC和RbohF基因在根、茎、叶和下胚轴中均表达,无组织特异性,但RbohC基因在根中表达量最高, RbohF基因在下胚轴中表达量最高。(4) 低温、干旱、盐、ABA、H₂O₂处理都能够诱导油菜RbohC和RbohF基因的表达,但抗寒性强的 ‘陇油6号’的RbohC和RbohF基因对胁迫的响应更敏感,且RbohC基因的表达量均高于RbohF基因。(5) 用H₂O₂清除剂DMTU、NADPH氧化酶抑制剂DPI和IMD、MAPKK抑制剂U0126处理后,油菜RbohC和RbohF基因的表达均较对照下降,说明U0126和DMTU对油菜RbohC和RbohF基因的表达有抑制作用。研究认为,油菜RbohC和RbohF基因在油菜适应逆境胁迫中具有重要作用,两基因的表达均受MAPK激酶信号途径的调节,并受到H₂O₂的反馈调节,而且抗寒性强的‘陇油6号’品种中RbohC和RbohF基因对H2O2和MAPK激酶信号途径的响应更敏感。     

柠条锦鸡儿F3H基因克隆及功能分析

柠条锦鸡儿为豆科灌木,对各种环境胁迫具有较强的适应能力,类黄酮是天然的抗氧化剂,花青素属类黄酮化合物,逆境胁迫会影响植物体内花青素的合成,而黄烷酮3-羟化酶(F3H)是花青素生物合成所必需的一种关键酶。该研究成功分离克隆了柠条锦鸡儿的F3H基因,命名为CkF3H。CkF3H基因的开放阅读框(ORF)为1095 bp,编码364个氨基酸,推测的蛋白质分子量为41.3 kDa,理论等电点为5.9。生物信息学分析发现,CkF3H基因序列与其它植物F3H有较高的一致性,推测CkF3H蛋白与其它植物F3H蛋白具有相似的功能。利用染色体步移法克隆得到CkF3H起始密码子ATG上游468 bp的启动子序列,PlantCARE软件分析表明,该序列具有启动子的基本元件CAAT-box和TATA-box以及多种与逆境胁迫相关的顺式调控元件。实时荧光定量PCR分析表明,CkF3H在柠条的根、茎和叶中均有表达,没有组织特异性;CkF3H的表达受低温、高盐、干旱和高温胁迫的诱导,并且在低温胁迫下,CkF3H的表达还受到光周期的影响。综上所述,研究结果表明CkF3H基因在柠条锦鸡儿适应低温、高盐、干旱和高温胁迫的过程中发挥作用。     

油菜RbohB基因的克隆及逆境响应表达分析

利用RACE技术从‘陇油6号’油菜中克隆得到一个新的RbohB基因,全长2 694 bp,开放阅读框2 541 bp,编码846个氨基酸。实时荧光定量PCR分析表明RbohB基因表达受低温、高盐、H₂O₂诱导,MAPKK抑制剂U0126预处理12 h再经低温、高盐、H₂O₂诱导,与单独处理结果相比,RbohB基因表达明显降低,表明该基因在油菜适应低温、高盐、H₂O₂胁迫过程中发挥作用,U0126对该基因的转录有抑制作用。NADPH氧化酶活性受H₂O₂处理的诱导,U0126预处理12 h再经H₂O₂处理,与单独H₂O₂处理结果相比,NADPH氧化酶活性明显降低,表明MAPKK抑制剂U0126对该酶活性有抑制作用。     

α-萘乙酸对低温胁迫下油菜幼苗抗寒性的影响

为探究α-萘乙酸(NAA)对植物抗寒性的影响,以白菜型冬油菜‘陇油6号’为试验材料,经4℃、NAA+4℃、NAA+4℃+DPI(NADPH氧化酶抑制剂)、NAA+4℃+DMTU(H2O2清除剂)、NAA+4℃+U0126(MAPK抑制剂)和NAA+4℃+Tungstate(NO生成抑制剂)处理后,研究其对‘陇油6号’油菜的活性氧(H2O2和O2-·)含量,抗氧化酶活性,丙二醛(MDA)、可溶性糖、脯氨酸和叶绿素含量,抗氧化酶基因(APX、CAT、GR、SOD)、Rboh A-F、MAPK3/4/6、CBF和ICE1基因表达量的影响。结果表明:与4℃低温处理相比,NAA+4℃处理下油菜根系中的细胞活性、H2O2和O2-·含量以及叶片中的MDA含量均降低;根系中的抗氧化酶(CAT、SOD、APX和POD)活性、叶片中的可溶性糖及脯氨酸含量、叶绿素含量、上述相关基因的表达量均升高,说明α-萘乙酸处理油菜可显著提高低温胁迫下油菜幼苗的抗氧化能力、光合能力和相关基因的表达,增强油菜幼苗的抗寒性。与NAA+4℃处理相比,NAA+4℃+抑制剂(DPI、DMTU、U0126和Tungstate)处理下油菜幼苗中叶绿素含量、抗氧化酶基因表达量、Rboh A-F、MAPK3/4/6、CBF和ICE1基因表达量均呈不同程度降低,说明H2O2和NO信号分子、NADPH氧化酶和MAP激酶级联途径均参与了α-萘乙酸增强油菜幼苗耐寒性过程的调控。