地鼠肾细胞培养的CTN株狂犬病新疫苗研究

应用细胞毒种代替豚鼠脑毒种制备狂犬病地鼠肾细胞纯化疫苗。将狂犬病毒CTN株在原代地鼠肾细胞（PHKC）传代适应,用病毒培养液上清作为生产用毒种,结果通过在PHKC传10多代,适应后病毒滴度达到了7.0LogLD50/ml,并应用适应株（CTN－LS－HK）细胞毒种制备三批疫苗,其效力在6.11-6.55IU/ml,高于用aG株豚鼠脑毒种制备的三批疫苗效力（3.77-5.85IU/ml)。     

一种人源抗狂犬病病毒单克隆抗体的瞬时表达及性质分析

目的瞬时表达人源重组抗狂犬病病毒单克隆抗体,并对抗体性质进行分析。方法 PCR法扩增抗体轻、重链可变区并分别构建真核表达质粒;瞬时转染HEK293 EBNA1细胞;抗体经亲和纯化后,CE-SDS法分析纯化后抗体单体比例,用快速荧光灶抑制试验(RFFIT)分析抗体体外抗狂犬病病毒中和活性,ELISA分析抗体与3aG、CTN、PV及CVS株的结合。结果提取瞬时表达质粒的A260/280 nm比值在2.0～2.1之间纯化后抗体非还原CE-SDS单体纯度为74.4%;还原CE-SDS抗体轻、重链峰合计占比超过95%;抗体RFFIT体外中和活性为293.37 IU/mL,比活达628.21 IU/mg,抗体与3aG、CTN、PV及CVS株交叉反应均为阳性。结论该株抗体具有较高体外抗狂犬病病毒中和活性,与主要疫苗株均有较强结合。     

不同狂犬病毒株抗原反应性的比较研究

应用ELISA法对285份免疫前及健康人血清和742份以不同毒株制备的狂犬病疫苗(aG株、CaG株、CTN株,PM株)全程免疫后人群的血清标本进行抗狂犬病毒抗体的检测。结果显示CTN株病毒抗原对不同毒株狂犬病疫苗免疫后血清的抗体阳性检出率均能达到90％以上,且与SNT效价的相关性较好;而aG株抗原对除aG株以外其它毒株狂犬病疫苗免疫后血清的阳性检出率仅为50％左右。因此不同毒株狂犬病毒抗原的反应性存在明显差异,选用纯度高、活性好的CTN株病毒或两株病毒以不同比例混合作为ELISA检测用抗原,测定疫苗免疫后人群的抗体水平,可获得满意的结果。     

狂犬病疫苗接种者血清对狂犬病病毒中和能力研究

狂犬病（Rabies）是由狂犬病病毒属成员（Lyssavirus）引起的人兽共患病,全球99%以上人狂犬病是由该属主要成员狂犬病病毒（Rabies virus,RABV）引起的。近年来,我国RABV毒株多样性明显增多,但是现有狂犬病疫苗对不同毒株（特别是新出现的毒株）免疫保护效果尚不清楚。为研究目前商品化的人用狂犬病疫苗对RABV街毒株是否具备交叉免疫保护能力,本研究通过制备不同进化群、不同宿主来源的3株街毒株GDMMD16、NMALSF01和NeiMeng927A的细胞毒,分别对免疫过aG株和/或PM株狂犬病疫苗的23份人血清进行狂犬病荧光抗体病毒中和实验,结果发现所有血清对GDMMD16、NMALSF01和NeiMeng927A街毒株的中和效价均高于WHO推荐的标准（0.5IU/mL）,表明上述2种商品化的人用狂犬病疫苗对3株RABV街毒株具有保护能力。     

狂犬病疫苗株病毒aG株全基因序列测定及特征分析

对我国狂犬病疫苗生产株aG株进行全基因序列测定分析,为完善aG株毒种的质量控制提供数据支持。将aG株病毒全基因组RNA分成8段进行RT-PCR分段扩增,其中基因组5′末端采取5′RACE方法,将PCR扩增产物分别克隆入pGEM-T载体中,测定序列并拼接获得病毒全基因序列;用DNAStar软件包中的相应软件对基因全序列进行分析,并与国内外主要狂犬病疫苗生产株进行基因同源性分析和主要抗原位点比较。aG株病毒基因组序列全长11 925bp(GenBank登录号为JN234411),属基因Ⅰ型狂犬病病毒;各疫苗株生物信息学分析表明,各株病毒存在同源性差异。本研究获得了aG株病毒全基因组序列,对aG株基因特征进行了分析并将其与国内外疫苗株进行了比较,为完善其质量控制提供了参考和数据支持。     

用CaG株毒种制备精制狂犬病疫苗的研究

通过对狂犬病毒aG株在金黄地鼠肾细胞上传代培养,获得一种新型狂犬病毒毒株,即地鼠肾细胞适应株(CaG株)[1].由于该毒种具有生产方法简单,成本低廉,且外源因子污染机率小等优点,因此试用该毒种生产精制狂犬病疫苗.在相同条件下,分别用豚鼠脑毒种和细胞毒种各生产3批病毒原液,经相同纯化工艺制备成精制狂犬病疫苗.经初步检定用细胞毒种制备的疫苗安全性良好,疫苗免疫效价与豚鼠脑毒种疫苗无明显差异.     

狂犬病病毒抗体胶体金检测试纸的制备

通过胶体金免疫层析技术建立一种特异、便捷、快速的狂犬病病毒抗体检测方法,对犬等动物免疫狂犬病疫苗后的抗体水平监测提供参考。用醋酸锌沉淀法沉淀狂犬病病毒CVS11,Sepharose 4FF进行层析纯化。用柠檬酸三钠还原法制备的胶体金,标记纯化的狂犬病病毒,喷于试纸的结合释放垫 (金标垫),将SPA (葡萄球菌表面A蛋白) 和纯化的兔抗狂犬病病毒IgG分别喷于试纸的T (检测线) 处和C (对照线) 处,组装试纸条。用制备的试纸条对261份犬血清进行检测,与快速荧光灶抑制试验 (RFFIT) 检测的结果一致;对已知效价的犬狂犬病毒中和抗体 (VNA) 大于0.5 IU,结果为阳性;对狂犬病病毒中和抗体 (VNA) 小于0.5 IU/mL的血清,结果为阴性。制备的狂犬病病毒抗体胶体金检测试纸检测犬血清抗体,具有特异、便捷、快速的特点,能够检测出狂犬病病毒中和抗体大于0.5 IU的血清,适用于临床犬血清抗体水平监测,具有良好的应用前景。     

狂犬病病毒Vero细胞适应株3aG-V的致病性和免疫原性

狂犬病病毒3aG—V株是3aG—5在vero细胞适应的毒株,对其在小鼠、豚鼠、家兔、犬的不同感染途径的致病性,小鼠、豚鼠、兔子上的免疫原性进行研究,同时进行纯毒及在中枢神经系统中能否形成尼氏小体试验,结果表明：狂犬病病毒3aG—V株潜伏期较长,在动物脑内不形成尼氏小体,为固定毒,其在实验动物上具有较弱的致病性和较好的免疫原性,可作为纯化Vero细胞狂犬病疫苗的生产用疫苗株。     

狂犬病病毒aG株全基因组序列测定及遗传稳定性分析

目的探究狂犬病病毒(Rabies virus,RV)aG株全基因组序列特征及遗传稳定性。方法严格按疫苗生产工艺进行传代,提取主种子批、工作种子批及疫苗原液病毒RNA,通过RT-PCR技术扩增全基因组各片段基因,然后分别将其克隆到p GEM-T载体中,并进行序列测定;采用DNAStar软件包对aG株与Gen Bank中4aGV参考株(JN234411)以及18株基因1型RV参考株进行同源性分析。结果 aG株全基因组由11 925个核苷酸组成,共编码3 600个氨基酸。疫苗原液与主种子批全基因组核苷酸和氨基酸同源性均为100%,而工作种子批与主种子批的核苷酸与氨基酸同源性分别为99.97%和99.92%;aG株与4aGV参考株全基因组核苷酸与推导的氨基酸同源性均为99.9%,其与18株基因1型参考株核苷酸与氨基酸序列同源性分别为84.2%~97.6%和93.7%~98.3%;aG株传代病毒与4aGV参考株全基因组氨基酸序列高度保守,且各主要功能区未发生变异。结论狂犬病病毒aG株在实验室长期生产传代过程中,全基因组遗传特性稳定。     

RFFIT、FAVN、ELISA及狂犬病中和抗体检测试剂盒对狂犬病抗体检测的比较研究

为了比较RFFIT、FAVN、ELISA及狂犬病中和抗体检测试剂盒(RVNA Kit)等四种方法对狂犬病抗体的检测效果,对65份狂犬病疫苗免疫前、免疫后临床血清样本,分别使用RFFIT、FAVN、ELISA及RVNA Kit方法对狂犬病病毒特异性抗体进行测定,并对检测结果的阳性符合率、相关性及重复性进行分析。检测结果显示,RFFIT、FAVN及RVNA kit的阳性符合率为100%,三种方法与ELISA试剂盒的阳性符合率为95.38%,对0.5IU/mL~10IU/mL的血清样本进行阳性符合率分析显示,四种方法的阳性符合率为100%;相关性研究结果表明,RFFIT、FAVN及RVNA Kit之间任意两种方法检测结果的相关系数均超过0.97,但ELISA与其他三种方法检测结果的相关系数均低于0.86;同一份样品的重复性检验结果显示,RVNA Kit和ELISA比RFFIT和FAVN具有更好的重复性,而RVNA Kit的重复性最好,其变异系数仅6%。研究结果表明,RFFIT、FAVN及RVNA Kit等三种方法可通用于血清中抗狂犬病病毒中和抗体的检测,而ELISA检测结果与中和抗体效价有一定差距,但在经过优化、校验后ELISA也可以在有效范围内用于狂犬病抗体的检测。     

1株梅花鹿源狂犬病街毒株全基因组测序与分析

对1株梅花鹿源性狂犬病街毒株(DRV)进行全基因组克隆,对全长cDNA进行测序分析.RT-PCR扩增克隆覆盖全基因组9个重叠基因片段,基因组3'和5'末端采取3,-RACE和5'-RACE方法,9个重叠基因片段序列拼接得到DRV全基因组cDNA序列,共11 863个核苷酸.DRV毒株全基因组构成与其他狂犬病毒基因组构成相似,由5个编码区组成,基因起始位点和终止位点高度保守,在核蛋白和糖蛋白的重要抗原位点有个别氨基酸发生变异,对已完成全基因组测序的几个基因1型毒株分别进行了N、P、M、G、L基因核苷酸及氨基酸的同源性比较.与其他具有代表性的毒株进行N基因序列比较建立的系统进化树表明,DRV毒株属于基因1型,与中国人用疫苗株3aG同源性最高为94%,与分类位置未确定的北高加索毒株(WCBV)的同源性最低为71%.本研究结果可为狂犬病毒各项分子生物学研究提供理论参考.     

重组人抗狂犬病病毒单抗SO57、SOJB对不同狂犬病病毒毒株中和作用的研究

用不同的动物模型研究了具有专利的重组人抗狂犬病病毒单克隆抗体SO57、SOJB对不同狂犬病病毒株的中和作用,100IU/kg的SO57能100%保护被中国街毒株SBD攻击的中国仓鼠;首次用小鼠模型模拟人体被狂犬病病毒攻击后的治疗情况,在小鼠被CVS及中国街毒代表株攻击后,SO57与HRIG具有相近的对小鼠的暴露后保护作用;同时结果显示HRIG对SBD株攻击的保护率不能到达100%,仅使用疫苗是不能对感染病毒的小鼠百分之百的保护;SOJB与SO57 1:1联合使用未显示比SO57单独使用更好的保护效果。SO57极有可能在中国代替HRIG用于狂犬病病毒暴露后治疗。     

用火箭电泳法检测人用狂犬病疫苗半成品抗原含量初探

用火箭电泳法（ＲＩＥ）检测了５批ａＧ株地鼠肾细胞人用狂犬病疫苗半成品（未加吸附剂）的抗原含量。结果表明,ＲＩＥ法快速、简便、准确。峰高与浓度的线性相关系数ｒ〉０．９９５０,待检疫苗与标准品的剂量反应曲线高度一致,试验的灵敏度为０．１５ＩＵ／ｍｌ,重复性好,５次结果的变异系统ＣＶ％≤５．７４％。因此,ＲＩＥ法有可能作为检测狂犬病疫苗半成品抗原含量的适宜方法     

A Novel Rabies Vaccine Based on a Recombinant Parainfluenza Virus 5 Expressing Rabies Virus Glycoprotein

Untreated rabies virus (RABV) infection leads to death. Vaccine and postexposure treatment have been effective in preventing RABV infection. However, due to cost, rabies vaccination and treatment have not been widely used in developing countries. There are 55,000 human death caused by rabies annually. An efficacious and cost-effective rabies vaccine is needed. Parainfluenza virus 5 (PIV5) is thought to contribute to kennel cough, and kennel cough vaccines containing live PIV5 have been used in dogs for many years. In this work, a PIV5-vectored rabies vaccine was tested in mice. A recombinant PIV5 encoding RABV glycoprotein (G) (rPIV5-RV-G) was administered to mice via intranasal (i.n.), intramuscular (i.m.), and oral inoculation. The vaccinated mice were challenged with a 50% lethal challenge dose (LD₅₀) of RABV challenge virus standard 24 (CVS-24) intracerebrally. A single dose of 10⁶ PFU of rPIV5-RV-G was sufficient for 100% protection when administered via the i.n. route. The mice vaccinated with a single dose of 10⁸ PFU of rPIV5-RV-G via the i.m. route showed very robust protection (90% to 100%). Intriguingly, the mice vaccinated orally with a single dose of 10⁸ PFU of rPIV5-RV-G showed a 50% survival rate, which is comparable to the 60% survival rate among mice inoculated with an attenuated rabies vaccine strain, recombinant LBNSE. This is first report of an orally effective rabies vaccine candidate in animals based on PIV5 as a vector. These results indicate that rPIV5-RV-G is an excellent candidate for a new generation of recombinant rabies vaccine for humans and animals and PIV5 is a potential vector for oral vaccines.     

不同狂犬病毒株在地鼠肾细胞上培养的病毒滴度与免疫原性比较

三个狂犬病毒株,分别经地鼠肾细胞培养,将其抗原含量,病毒滴度和免疫原性进行比较。结果显示,三个病毒株的抗原含量有差异。但差异显著性,CTN-V10M3的毒力最高,CTN-BHK3的毒力最低,aG株的毒力虽然居中,但免疫原性最好,它仍是最适于地鼠肾细胞上培养的毒株。     

狂犬病毒核蛋白(NP)的纯化及其免疫原性的研究

对重组痘苗病毒和重组杆状病毒表达的狂犬病毒NP及原代地鼠肾细胞培养的狂犬病毒核衣壳蛋白（RNP）,先经Sepharose CL 4B分子筛柱初步提纯,再以抗狂犬病毒NP McAB 2C12-Sepharose 4B亲和层析柱纯化分离,经ELISA,SDS-PAGE电泳和Western-Blot分析证实,获得了高纯度和免疫反应性的NP和RNP。以相同剂量的纯化蛋白免疫小鼠,RNP和两种重组NP均可诱生特异的抗NP抗体,三种蛋白间无明显差异;狂犬病毒CVS株攻击保护实验结果显示,三种蛋白免疫的小鼠存活率约为50%;两种重组NP的免疫反应性和免疫原性与天然狂犬病毒RNP相似。     

狂犬病毒核蛋白（NP）的纯化及其免疫原性的研究

对重组痘苗毒和重杆状病毒表达的狂犬病毒NP及原代地鼠肾细胞培养的狂犬病毒核衣壳蛋白（RNP）、先经Sepharose CL 4B分子筛柱初步提纯,再经抗狂犬病毒NP McAB 2C12-S-epharose 4B亲和层析柱纯化分离,经ELISA、SDS－PAGE电泳和Western-Blot分析证实,获得了高纯度和免疫反应性的NP和RNP。以相同剂量的纯化蛋白免疫小鼠,RNP和两种重组NP均可诱生特异的抗NP抗体,三种蛋白间无明显差异;狂犬病毒CVS株攻击保护实验结果显示,三种蛋白免疫的小鼠存活率约为50％;两种重组NP的免疫反应性和免疫原性与天然狂犬病毒RNP相似。     

高效价冻干人用狂犬病疫苗暴露后免疫程序的研究

初步确定高效价冻干人用狂犬病疫苗（6．0IU／剂）暴露后免疫程序。制备高效价的冻干人用狂犬病疫苗（6．0IU／剂）,以狂犬病街毒CNX8601和BD06分别攻击小鼠和比格犬的咬肌,接种不同效价的狂犬病疫苗,以RFFIT法检测中和抗体,根据动物死亡情况,计算暴露后疫苗保护率,对不同效价的疫苗进行中和抗体测定和保护率统计分析。在以小鼠为实验动物的疫苗保护率研究中,冻干人用狂犬病疫苗（3．1IU／剂）0／3／7／14／28免疫程序的保护率为40．6％,高效价的冻干人用狂犬病疫苗（6．0IU／剂）0／3／14免疫程序的保护率为56．2％,中和抗体比较,P〈0．05,2组间有显著性差异;在以比格犬为实验动物的保护效果研究中,冻干人用狂犬病疫苗的保护率（3．1IU／剂）为70％;高效价的冻干人用狂犬病疫苗（6．0IU／剂）的保护率为80％,中和抗体的比较,P〉0．05,没有显著性差异。高效价冻干人用狂犬病疫苗暴露后免疫程序可初步确定为0、3、14d免疫。