人源抗狂犬病病毒单克隆抗体的构建及验证

目的利用人源抗狂犬病病毒ScFv噬菌体抗体库,构建单克隆抗体(单抗)轻、重链质粒,瞬时表达,纯化后验证具有高中和活性的单抗。方法以从ScFv噬菌体抗体库中筛选获得特异性抗体为模板,PCR扩增抗体轻、重链可变区序列,构建人源全分子抗体瞬时转染质粒;轻、重链质粒混合后转染HEK293 EBNA1细胞,瞬时表达全分子抗体。采用Mabselect SuRe介质手动亲和纯化抗体,Nano Vue超微量分光光度计测定蛋白质的质量浓度,快速荧光灶抑制试验(rapid fluorescent focus inhibition test, RFFIT)进行体外中和效价验证。结果成功构建22个轻链质粒,15个重链质粒。通过真核细胞瞬时表达后,经手动亲和纯化后,获得22株单抗。除1株抗体外,其余21株抗体的蛋白质量浓度均>300μg/mL;部分抗体纯度均在90%以上。中和活性结果显示,5株在1 500~1 800 IU/mg之间;8株在800~1 500 IU/mg之间;7株在500~800 IU/mg之间;其余2株在500 IU/mg以下。结论成功构建并验证获得20株中和活性>500 IU/mg的人源抗狂犬病病毒单抗,为单抗混合制剂的研究奠定了基础。     

三种淋巴瘤细胞CD52抗原呈现稳定性研究及其应用

评估淋巴瘤细胞MC/CAR、HUT78和RAMOS的CD52抗原呈现稳定性,并比较三种细胞用于抗CD52单抗活性检测中的优劣性。采用免疫荧光法检测淋巴瘤细胞MC/CAR、HUT78和RAMOS的CD52抗原呈现率,分析MC/CAR、HUT78和RAMOS传代培养5~20代CD52抗原呈现稳定性。分别以MC/CAR、HUT78和RAMOS作为抗CD52单抗结合活性和补体依赖细胞毒性的靶细胞进行检测,并比较其优劣性。结果显示,MC/CAR、RAMOS和HUT78的CD52抗原呈现率分别为95.5%、63.2%和38.3%。MC/CAR传代培养5~20代CD52抗原呈现率均大于90%。RAMOS传代培养5~13代CD52抗原呈现率介于60%~67%,第14~15代CD52抗原呈现率介于50%~60%,第16~20代细胞CD52抗原呈现率介于40%~50%。HUT78传代培养5~20代CD52抗原呈现率介于26.7%~38.9%。淋巴瘤细胞MC/CAR在抗CD52单抗的结合活性检测中呈现出更好的剂量依赖曲线。淋巴瘤细胞RAMOS在抗CD52单抗的补体依赖细胞毒性检测中呈现出更好的剂量效应曲线。CD52抗原呈现率方面MC/CAR>RAMOS>HUT78。结果表明,MC/CAR更适用于抗CD52单抗的结合活性的检测,RAMOS适用于抗CD52单抗的补体依赖细胞毒性检测。     

阳离子交换高效液相色谱检测重组人源化抗CD52单克隆抗体的电荷异质性

目的建立阳离子交换高效液相色谱检测重组人源化抗CD52单克隆抗体(monoclonal antibody,m Ab)电荷异质性的方法,并对其进行验证。方法基于m Ab等电点呈弱碱性,且因为抗体所带电荷的不同导致其与色谱柱结合力的不同,采用"PropacTMWCX-10"弱阳离子交换柱,利用盐梯度洗脱的方法依次洗脱出m Ab的酸性电荷变异体、中性电荷变异体及碱性电荷变异体;对方法的专属性、线性、准确性、精密度和耐用性进行验证。结果阳离子交换高效液相色谱分析重组人源化抗CD52 m Ab各电荷变异体的保留时间在14~21 min之间,其中酸性电荷变异体的保留时间在14~17 min,中性电荷变异体的保留时间在17~18 min,碱性电荷变异体的保留时间在18~21 min之间。专属性验证显示空白辅料对照色谱图在样品出峰位置无干扰。线性验证显示酸性电荷变异体、中性电荷变异体和碱性电荷变异体相关系数R2均0.99。准确性验证显示酸性电荷变异体、中性电荷变异体和碱性电荷变异体回收率分别为99.3%~99.9%、99.8%~100.4%和99.3%~99.7%。仪器重复性、样品重复性和中间精密度验证中,各电荷变异体的RSD均5%。耐用性验证中,流动相p H在8.0±0.1、流动相中盐浓度为100 mmol/L±5 mmol/L、柱温在(30±2)℃变化时各电荷变异体的RSD均5%。结论阳离子交换高效液相色谱可以有效分离重组人源化抗CD52 m Ab的酸性电荷变异体、中性电荷变异体和碱性电荷变异体,且该方法具有良好的专属性、线性、准确性、精密度和耐用性。     

重组抗A型肉毒毒素人鼠嵌合单克隆抗体的瞬时表达及中和活性研究

为了制备重组抗A型肉毒毒素(botulinum neurotoxin A,BoNT/A)人鼠嵌合单克隆抗体并分析中和活性,以BoNT/A作为抗原筛选鼠源抗BoNT/A噬菌体单链抗体库,将筛选得到的鼠源抗BoNT/A特异性单链抗体的重链和轻链可变区分别克隆到pGP5KCγ和pGP5KCκ载体构建表达质粒。表达质粒共转染HEK-293EBNA1细胞,瞬时表达抗BoNT/A人鼠嵌合单克隆抗体(monoclonal antibody,mAb)。蛋白A亲和纯化mAb,分子排阻高效液相色谱(size exclusion high performance liquid chromatography,SEC-HPLC)分析mAb纯度,小鼠中和试验评价mAb中和活性。结果显示,经过筛选得到4个序列正确且各不相同的抗BoNT/A单链抗体。4个抗BoNT/A人鼠嵌合mAb表达质粒均构建成功并转染HEK-293EBNA1细胞,根据转染效率指示绿色荧光蛋白的表达推测,50%～62. 5%的细胞表达抗BoNT/A抗体。表达上清经过蛋白A亲和纯化,浓度均200μg/mL,单体纯度均90%。小鼠中和试验显示mA1、mA2、mA3和mA4单株抗体均不能完全中和4 LD_(50)的A型肉毒毒素,但从延迟小鼠生存时间可以得出4个抗体的中和活性为mA3mA2mA1mA4。mA1、mA2、mA4中任何一个抗体与mA3连用中和活性为80 LD_(50)/mg。本研究制备了4个具有不同程度中和活性的抗BoNT/A人鼠嵌合mAb,为A型肉毒神经毒素鸡尾酒疗法奠定了基础。     

SYBR Green实时定量PCR分析灌注培养工艺中抗体基因稳定性

目的采用SYBR Green实时定量PCR分析灌注培养工艺过程中工程细胞株抗体基因的稳定性。方法取灌注培养0、7、14、21、28、35 d的CHO细胞,用SYBR Green实时定量PCR分析其抗体基因稳定性。使用标准曲线相对定量法分析CHO细胞中β-肌动蛋白和抗体基因拷贝数,以抗体基因拷贝数与β-肌动蛋白基因拷贝数的比值表示工程细胞中抗体基因水平。结果工程细胞株工作种子、发酵罐中不同时间点样品抗体基因拷贝数保持稳定,抗体基因拷贝数相对β-肌动蛋白基因为0.93±0.10,抗体基因相对含量与培养时间之间不相关(P=0.938)。结论抗体工程细胞株在灌注培养过程中抗体基因保持稳定。     

应用CE-SDS测定抗CD52人源化单克隆抗体参比品单体纯度及非糖化重链比例

目的:测定抗CD52人源单克隆抗体参比品单体纯度及非糖基化重链比例。方法:采用PA800 plus毛细管电泳系统,非还原十二烷基苯硫酸钠-毛细管电泳(CE-SDS)测定抗CD52人源单克隆抗体单体纯度,以及用还原CE-SDS电泳测定非糖化重链比例。结果:非还原CE-SDS三次测定单体纯度平均值为93.57%,主峰的迁移时间及修正峰面积百分比RSD分别为0.16%和0.19%;还原CE-SDS电泳重链修正峰面积百分比平均值为66.89%,修正峰面积百分比及迁移时间RSD分别为0.09%和0%;轻链修正峰面积百分比平均值为32.30%;轻链修正峰面积及迁移时间RSD分别为0%和0%;非糖基化重链修正峰面积百分比平均值为0.87%,修正峰面积百分比及迁移时间RSD分别为6.66%和0.27%。结论:CE-SDS测定抗CD52人源单抗单体纯度及非糖化重链比例实验结果偏差较小,表明结果准确可靠。