小鼠mP24基因的原核表达及多抗制备

目的：本研究是为后续实验中深入研究小鼠mP24基因的功能及活性提供mP24多克隆抗体。方法：mP24是小鼠中新发现的新基因,通过构建了pET-28a（＋）/mP24原核表达质粒,转化入大肠杆菌BL21（DE3）中,IPTG诱导宿主细菌表达融合蛋白。经过SDS-PAGE分析,结果表明该蛋白能以可溶性蛋白形式存在。利用镍柱纯化融合蛋白,免疫新西兰兔,制备mP24多抗。结果：Western Blot结果显示,制备的抗小鼠mP24多克隆抗体具有较高的特异性。ELISA实验检测,该多抗对免疫抗原的效价高达1：9000,具有较高的效价。结论：本实验成功制备了mP24的多克隆抗体,为进一步开展mP24基因功能的研究奠定了基础。     

应用RNAi技术沉默大转录本基因LRP1B

低密度脂蛋白受体相关蛋白1B(Lipoprotein receptor-related protein 1 B, LRP1B)是脂蛋白受体家族庞大受体亚群的成员之一, LRP1B基因编码一个长达16.5 kb的大转录本。由于LRP1B的转录产物过大限制了其功能研究。为研究LRP1B基因与肿瘤转移的相关性, 文章应用RNAi技术特异地封闭了LRP1B基因的表达。在设计siRNA过程中, 根据高效siRNA序列特征和靶序列处的mRNA二级结构特点, 对LRP1B基因多达1 100个的siRNA候选靶序列进行双重评价, 最终在基因转录本的不同位置选取了6个siRNA靶位点。针对这些靶位点, 文章构建了6个表达shRNA的pSilencer4.1重组体, 稳定转染HEK 293细胞并采用半定量RT-PCR检测各表达载体的沉默效果。结果表明, 所构建的6个shRNA-pSilencer4.1重组体中有5个对LRP1B基因形成了有效沉默(＞50%), 并得到了多个完全封闭LRP1B基因表达的HEK 293细胞单克隆。