小鼠Prune蛋白DHH结构域的原核表达及多克隆抗体的制备

[目的]表达、纯化小鼠Prune蛋白DHH结构域(m-Prune D),并制备多克隆抗体。[方法]生物信息学方法分析m-Prune D氨基酸序列;PCR扩增目的基因m-Prune D,克隆入原核表达载体p ET28a(+);IPTG诱导目的基因表达,SDS-PAGE和Western Blot鉴定蛋白表达,亲和层析法纯化蛋白;用纯化的重组m-Prune D免疫小鼠制备多克隆抗体;Western Blot检测多克隆抗体特异性。[结果]PCR成功扩增m-Prune D基因,双酶切及测序结果表明成功构建m-Prune D原核表达载体,SDS-PAGE和Western Blot鉴定表明成功表达约25 k Da的重组蛋白。纯化蛋白免疫小鼠后抗体滴度最高可达1∶25 600,所制备的多克隆抗体可特异性识别原核和真核细胞中DHH结构域蛋白。[结论]在E.coli中成功表达小鼠Prune蛋白DHH结构域,制备了多克隆抗体血清,可用于Prune蛋白生物学功能的进一步研究。     

人源核受体hLRH-1 的表达纯化及多克隆抗体制备

目的：制备抗人源核受体hLRH-1 的多克隆抗体,为进一步研究其功能奠定基础。方法：构建含有hLRH-1基因全长克隆的 原核表达载体pET507a-hLRH-1 并用IPTG 诱导其在Rosseta2 菌株中表达重组蛋白His-hLRH-1,经亲和层析纯化后按常规方法 免疫新西兰兔制备多克隆抗体,并用Western Blot 对其特异性进行鉴定。结果：原核表达载体pET507a-hLRH-1经测序证实构建 成功,将其转化大肠杆菌Rosseta2菌株后成功诱导表达重组蛋白His-hLRH-1,经纯化免疫新西兰兔后得到抗hLRH-1 多克隆抗 体,Western blot 证实抗体具有高度特异性。结论：成功表达His-hLRH-1 重组蛋白并制备出多克隆抗体,为进一步用于hLRH-1 的 免疫学检测及其功能研究奠定了基础。     

沙门菌外膜蛋白D的原核表达及多克隆抗体制备

目的:在大肠杆菌中表达沙门菌外膜蛋白(OMP)D,纯化后制备兔抗OMPD抗体。方法:用PCR方法从鼠伤寒沙门菌中扩增出ompD基因,并插入融合表达载体pET-28a(+)的多克隆位点,构建重组表达质粒pET28a(+)-ompD;以重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),筛选阳性重组菌株,经IPTG诱导目的蛋白表达,在变性条件下对目的蛋白进行亲和层析纯化;以表达的OMPD蛋白免疫家兔,制备抗OMPD的多克隆抗体并进行鉴定。结果:扩增了ompD基因,测序证实正确后亚克隆于表达载体pET-28a(+)中,经PCR筛选和酶切鉴定获得阳性克隆,经诱导在大肠杆菌中表达出相对分子质量为40×103的目的蛋白并进行纯化;纯化的OMPD免疫家兔后,能有效地刺激特异性抗体的产生,抗血清的效价达到1∶10000以上,且具有良好的特异性。结论:构建ompD基因的原核表达载体,并在大肠杆菌中获得高效表达;制备出兔抗OMPD抗体,效价及特异性均良好,为进一步制备肠黏膜高亲和力疫苗奠定了基础。     

中国旱獭β2m基因的克隆、原核表达及多克隆抗体的制备

目的克隆、原核表达中国旱獭β2m基因,并制备多克隆抗体。方法利用RT—PCR技术从中国旱獭脾细胞中扩增β2m基因,克隆至pET28a（＋）质粒,构建原核表达载体pET-28a（＋）-CWβ2m,再转化宿主菌Rosetta（DE3）pLacI诱导其表达。使用切胶回收纯化目的蛋白,将纯化蛋白免疫家兔制备多克隆抗体,并采用酶联免疫吸附实验检测抗体的灵敏度和特异性。结果克隆出的中国旱獭β2m基因,与GenBank已公布的土拨鼠的碱基序列一致;Western印迹结果显示克隆的β2m基因能在大肠埃希菌中高效表达,免疫家兔获得了高效价的多克隆抗体。结论成功克隆了中国旱獭β2m基因,在原核宿主中进行了高效表达,获得的多克隆抗体具有较高的效价。为人工制备MHC-Ⅰ类分子复合物,深入研究嗜肝病毒感染过程中特异性CTL应答和效应机制奠定了基础。     

人PD1胞外须基因的克隆、蛋白表达及抗体制备

目的：研究人PD1的生物学活性,制备人PD1胞外段区域及其特异性抗体。方法：用PCR方法扩增编码人PD1胞外段的基因序列（hPD1ecr）,将其克隆到原核表达载体pET28a（＋）中,并转化至大肠杆菌BL21（DE3）中诱导表达,表达蛋白用SDS-PAGE和Western blot鉴定。纯化目的蛋白免疫日本大耳白兔,制备多克隆抗体。通过酶联免疫吸附实验（ELISA）,流式细胞术检测抗体滴度及其特异性。结果：原核表达载体pET28a（＋）-PD1ecr成功构建,并可在大肠杆菌BL21（DE3）中诱导表达,得到的PD1胞外区蛋白经SDS-PAGE和Western blot鉴定正确。用纯化蛋白免疫日本大耳白兔,制备的多克隆抗体具有较强免疫特异性。结论：得到纯化的人PD1胞外蛋白,制备的多克隆抗体能够检测自然状态下人PD1蛋白,为进一步研究PD1功能奠定了实验基础。     

人Nek2蛋白原核表达纯化及其多克隆抗体制备

目的:通过原核表达系统表达人Nek2蛋白,优化表达条件并纯化Nek2蛋白,制备抗Nek2多克隆抗体。方法:将Nek2基因片段构建到原核表达载体pET30a(+)上,转化大肠杆菌BL21(DE3);加入诱导剂IPTG诱导表达,对诱导温度、诱导剂IPTG终浓度、诱导时间等条件进行优化;利用12%SDS-PAGE后250mmol/L KCl染色切胶纯化蛋白质,将纯化后的Nek2蛋白进行质谱鉴定;纯化Nek2蛋白免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体,运用ELISA、Western blot和免疫荧光实验检测多克隆抗体效价和特异性。结果:构建了pET30a(+)-Nek2重组原核表达质粒,诱导的重组人Nek2蛋白主要以包涵体的形式存在;蛋白质的最适诱导表达条件为28℃,180r/min条件下加入终浓度为0. 2mmol/L IPTG诱导32h;质谱分析纯化后的蛋白质为Nek2蛋白,最终获得浓度为1. 35mg/ml纯化后的Nek2蛋白;纯化蛋白免疫小鼠,多克隆抗体效价大于1∶243 000,且具有良好的抗原特异性;免疫荧光实验显示Nek2主要定位于细胞质和细胞核。结论:利用重组人Nek2蛋白获得具有良好抗原特异性的抗Nek2多克隆抗体。     

小鼠OAZ2基因的原核表达及抗体制备

目的:克隆小鼠鸟氨酸脱羧酶抗酶2(OAZ2)功能基因,原核表达、纯化OAZ2蛋白并制备抗OAZ2多克隆抗体.方法:IRT-PCR法从鼠黑色素瘤细胞总RNA中克隆OAZ2 cDNA后,通过重叠延伸PCR技术构建无需移码即可全长翻译的功能基因.将OAZ2功能基因克隆人原核表达载体pET15b并原核表达.表达的蛋白经Ni-NTA亲和层析纯化后,用SDS-PAGE和Western Blot分析鉴定.用纯化的OAZ2蛋白作为抗原免疫Bab/C小鼠以制备多克隆抗体,制备抗体用ELISA和Western Blot检测抗体滴度和特异性.结果:成功获得小鼠OAZ2 cDNA并构建出无需移码翻译的OAZ2功能基因.OAZ2功能基因在大肠杆菌BL21(DE3)中可诱导性高表达并能用Ni-NTA树脂高效纯化.用纯化蛋白免疫Bab/C小鼠制备的抗血清经ELISA检测有较高的多克隆抗体效价(＞1∶64000),经Western blot鉴定可与纯化的OAZ2蛋白质特异性结合.结论:建立了鼠OAZ2蛋白原核表达和纯化技术,制备出高效价和特异性抗OAZ2多克隆抗体,为进一步研究OAZ2基因的功能奠定了基础.     

Carboxin抗性基因(Cbx~R)原核表达及多克隆抗体的制备

[目的]克隆CbxR基因,进行原核表达,纯化CbxR基因蛋白并制备其多克隆抗体。[方法]CbxR基因克隆至原核表达载体p ET-28a(+),转化大肠杆菌BL21(DE3)诱导表达并纯化,Western blot鉴定分析。制备CbxR蛋白的兔源多克隆抗体,运用间接ELISA方法检测多抗效价,利用Western blot印记检测抗体特异性。[结果]成功获得CbxR基因,在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导可大量表达,成功制备CbxR蛋白兔源多克隆抗体,效价为1∶64 000,经Western blot检测表明多克隆抗体特异性良好。[结论]多克隆抗体为CbxR检测及进一步研究CbxR基因功能奠定了基础。     

肺炎链球菌SpxA蛋白的原核表达、纯化及多克隆抗体的制备

目的 构建肺炎链球菌SpxA蛋白的原核表达系统,制备其多克隆抗体.方法 设计引物,利用PCR技术扩增肺炎链球菌D39菌株的spxA基因,并插入表达载体pET-28a（＋）内,测序鉴定.重组质粒转化至大肠埃希菌BL21（DE3）中,以IPTG诱导表达含6个组氨酸标签的SpxA重组蛋白,经Ni-NTA亲和层析柱纯化后,以其为抗原免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体.用ELISA及Western印迹方法分别检测多克隆抗体的效价及特异性.结果 从大肠埃希菌中诱导出高表达的SpxA重组蛋白,纯化后免疫小鼠获得抗血清,ELISA测定其效价可达1：2 560 000以上,Western印迹结果显示其能特异性地作用于肺炎链球菌SpxA.结论 成功构建了pET-28a（＋）-spxA原核表达质粒,获得了高纯度的目的 蛋白和高滴度、高特异性的多克隆抗体.     

粗糙脉孢菌ERG-11蛋白抗原的原核表达、纯化及其多克隆抗体制备

构建p ET-28a(+)-ERG-11重组质粒,表达6×His-ERG-11融合蛋白,制备ERG-11多克隆抗体。采用PCR技术扩增目的片段,插入p ET-28a(+)原核表达载体,并转入E.coli BL21(DE3)感受态表达融合蛋白,融合蛋白经亲和纯化及分子筛纯化后免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,取血清后,采用间接ELISA法和Western blot法检测多克隆抗体的效价及特异性。成功构建了p ET-28a(+)-ERG-11表达载体,SDS-PAGE电泳显示成功诱导出以包涵体形式存在的6×His-ERG-11融合蛋白,两步纯化后得到纯度较高的抗原,间接ELISA法显示制备的多克隆抗体效价达到1∶512 000,Western blot显示具有较高特异性。成功实现了粗超脉孢菌ERG-11蛋白的原核表达,制备出一支兔抗粗超脉孢菌ERG-11的多克隆抗体。     

猪FcγRIII的原核表达及多克隆抗体的制备

目的：构建猪FcγRIII 基因的原核表达载体,诱导表达重组蛋白,制备鼠抗猪 FcγRIII 抗血清。方法：从质粒pTG19-T-FcγRIII中用PCR方法克隆到编码完整猪FcγRIII蛋白分子的基因片段,将其插入到原核表达载体pET-32a中,构建了猪FcγRIII 原核表达载体pET-FcγRIII ,转化大肠杆菌BL21 (DE3) ,IPTG诱导蛋白表达,经尿素洗涤纯化后,以纯化后的融合蛋白FcγRIII-His 为抗原免疫小鼠,获得抗血清。Western blotting、ELISA 法鉴定获得的抗血清,ELISA 结果显示抗体效价为1∶16000,具有高度特异性,免疫印迹结果显示制备的多抗可以与重组猪FcγRIII蛋白特异性结合。结果：成功构建猪FcγRIII原核表达载体,纯化到融合蛋白FcγRIII-His,用纯化的融合蛋白免疫小鼠制备了多克隆抗体,Western blotting、ELISA 法证实多克隆抗体制备成功。结论：成功获得了猪 FcγRIII 多克隆抗体,为进一步研究猪FcγRIII 蛋白的功能奠定了基础。     

小鼠mP24基因的原核表达及多抗制备

目的：本研究是为后续实验中深入研究小鼠mP24基因的功能及活性提供mP24多克隆抗体。方法：mP24是小鼠中新发现的新基因,通过构建了pET-28a（＋）/mP24原核表达质粒,转化入大肠杆菌BL21（DE3）中,IPTG诱导宿主细菌表达融合蛋白。经过SDS-PAGE分析,结果表明该蛋白能以可溶性蛋白形式存在。利用镍柱纯化融合蛋白,免疫新西兰兔,制备mP24多抗。结果：Western Blot结果显示,制备的抗小鼠mP24多克隆抗体具有较高的特异性。ELISA实验检测,该多抗对免疫抗原的效价高达1：9000,具有较高的效价。结论：本实验成功制备了mP24的多克隆抗体,为进一步开展mP24基因功能的研究奠定了基础。     

重组酶Exo、Beta和Gam在大肠杆菌中的表达与纯化

目的:构建exo、beta和gam基因的原核表达质粒,在大肠杆菌中表达、制备重组酶Exo、Beta和Gam。方法:将exo、beta和gam基因分别构建在原核表达载体pEGKG和pET28a上,分别转化大肠杆菌BL21(DE3)和DH5α,经IPTG诱导后,在大肠杆菌中获得可溶性表达蛋白,用柱层析方法纯化蛋白。结果:构建了原核表达质粒pET28a-exo、pET28a-beta、pET28a-gam和pEGKG-exo、pEGKG-beta、pEGKG-gam;SDS-PAGE结果表明重组酶融合蛋白His-Exo、GST-Exo、His-Beta、GST-Beta、His-Gam、GST-Gam得到可溶性表达;用His标签抗体和GST标签抗体通过Western印迹方法检测到纯化后的融合蛋白。结论:在大肠杆菌中诱导表达了λ噬菌体重组酶,并纯化获得了一定量的纯度较好的蛋白,为下一步制备检测用多克隆抗体奠定了基础。     

重组甘蔗花叶病毒E株系外壳蛋白的纯化及其多克隆抗体制备

目的：制备可用于甘蔗花叶病毒（ScMV）E株系（ScMV-E）检测用多克隆抗体。方法：将ScMV-E外壳蛋白（CP）基因连接到pET29a（＋）上,经PCR检测、酶切及测序鉴定获得重组质粒pET29a-CP,在大肠杆菌BL21（DE3）中诱导表达重组ScMV-E外壳蛋白;采用His Trap Kit纯化目的蛋白,作为抗原免疫新西兰大白兔,制备特异性抗体;通过间接ELISA、Western blot和组织印迹法检测所制备抗体的特异性。结果：SDS-PAGE分析表明,重组融合蛋白含6个组氨酸标记,相对分子质量约43000;Western blot检测显示所获得的抗体特异性良好,间接ELISA法测得血清的效价为1：81 920;甘蔗叶片的组织印迹检测结果显示杂交效果良好。结论：制备的多克隆抗体可直接用于ScMV-E检测,并有望用于制备ScMV-E检测试剂盒。     

金黄色葡萄球菌LDH多克隆抗体制备及其交叉反应性

目的:在原核载体中表达、纯化金黄色葡萄球菌乳酸脱氢酶,免疫小鼠获得多克隆抗体,使用多克隆抗体分析与其它菌种的交叉反应性。方法:复苏p ET28a-ldh/Bl21重组菌,IPTG诱导重组融合蛋白表达、以抗HIS标签的单克隆抗体进行western-blot鉴定重组蛋白。使用纯化的重组蛋白以及相应的佐剂免疫小鼠,利用ELISA测定血清抗体效价,并使用小鼠抗血清进行免疫印迹法鉴定重组蛋白的反应原性及其与金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、肺炎链球菌、粪肠球菌、大肠埃希菌的交叉反应性。结果:SDS-PAGE电泳在39 KDa处可见目的条带,免疫印迹法验证了重组LDH的表达,纯化后获得2.8 mg重组蛋白。纯化蛋白免疫小鼠能诱导产生特异性体液免疫应答,ELISA检测特异性Ig G效价为1:50000,western-blot鉴定显示所制备的多克隆抗血清能分别识别金黄色葡萄球菌重组及天然乳酸脱氢酶,但不识别表皮葡萄球菌、肺炎链球菌、粪肠球菌、大肠埃希菌中天然乳酸脱氢酶。结论:纯化的LDH具有良好的免疫活性,免疫小鼠获得高滴度的多克隆抗体。使用多克隆抗体western-blot显示与其它菌种LDH不存在交叉反应性,为后续使用该重组蛋白进行金黄色葡萄球菌感染的诊断研究奠定基础。     

人SCYL1-BP1重组蛋白的原核表达及分离纯化鉴定

前期研究结果发现,SCYL1-BP1具有细胞周期调控功能,同时具有肿瘤抑制因子的特性。目的:采用基因工程技术,构建SCYL1-BP1的大肠杆菌重组表达菌株,以获得足够量的高纯度目的蛋白,为后面进行一系列药理学检测及新药安全性测试奠定基础。方法:利用从人胎脑cDNA文库中克隆得到SCYL1-BP1基因克隆为模板,经PCR扩增,通过酶切位点克隆到新型原核表达载体pET-28b-SUMO上,转化大肠杆菌表达菌BL21(DE3)。经IPTG诱导表达,摸索优化表达条件,表达产物经Ni柱进行亲和层析纯化,后再进行SDS-PAGE和Western blot等分析鉴定。结果:成功构建了SCYL1-BP1的原核表达工程菌BL21(DE3)/pET-28b-SUMO-SCYL1BP1。SDS-PAGE和Western blot检验结果表明,诱导表达的融合蛋白His6-SUMO-SCYL1BP1的分子量约为65 kDa,主要以可溶的形式存在,且能被His标签抗体和SCYL1-BP1单克隆抗体特异性识别。结论:原核表达并纯化了人SCYL1-BP1融合蛋白,为其后续功能研究及性质实验奠定基础。     

Prokaryotic Expression,Purification, and Production of Polyclonal Antibody Against Novel Human Serum Inhibited Related Protein I (SI1)

A novel serum inhibited related gene (SI1) has been cloned in our lab by using mRNA differential display analysis of U251 cells in the presence or absence of serum, the expression of SI1 was dramatically inhibited by the addition of serum to serum starved cells. Previous reports suggested the potential significance of SI1 in regulating the cell cycle. In this study, the plasmid construction, protein expression and purification, as well as the generation of anti-SI1 polyclonal antibody are described. A full-length cDNA of Si1 was inserted in a prokaryotic expression plasmid pET28-b(+) and efficiently expressed in E. coli Rosetta (DE3) strain after induction by isopropyl-b-d-thiogalactoside. The expressed 6His-tagged SI1 fusion protein was purified by Ni⁺ affinity column and then used to immunize Balb/C mice, and the anti-SI1 polyclonal antibody was purified by protein A column. To determine the sensitivity and specificity of the antibody against SI1, a cell lysate of pEGFP-N2-SI1 plasmid transiently transfected Hela cell was identified by anti-GFP monoclonal antibody and anti-SI1 polyclonal antibody. Both the GFP-SI1 fusion protein and endogenous SI1 protein in Hela cell can be recognized by the anti-SI1 polyclonal antibody. The anti-SI1 polyclonal antibody will provide a useful tool for further characterization of SI1.     

sTACI-Fc-Myc重组质粒的构建、原核表达及活性鉴定

目的:构建s TACI-Fc-Myc重组质粒,并进行原核表达和纯化具有生物活性的融合蛋白。方法:通过PCR法获得s TACI-Fc-Myc重组片段,然后把融合基因片段与原核载体p ET28a连接在一起,并构建p ET28a-s TACI-Fc-Myc重组子,并转入BL21(DE3)中进行表达,用蛋白A凝胶亲和层析柱进行纯化及酶联免疫吸附剂(ELISA)法测定其生物学活性。结果:获得了s TACI-Fc-Myc重组质粒,且该质粒可以在BL21(DE3)中表达,亲和层析柱纯化后纯度可达到95%以上,与BAFF的结合活性具有剂量依赖性,浓度达到5 ng/μL时,两者的吸附达到饱和。结论:成功构建了s TACI-Fc-Myc原核表达载体,并使有生物学活性的融合蛋白在BL21(DE3)上获得了稳定表达,为进一步研究并筛选高活性BAFF拮抗肽奠定了基础。