酵母转录调控因子PHO81的结构与功能

本文发现ＰＨＯ８１蛋白上的碱性区和酸性区附近的微小变化可导致ｒＡＰａｓｅ的表达向组忝型转化,且这两个区域是协同作用的,而酸性区的净负电荷的降低能使ｒＡＰａｓｅ的活力降低。     

酵母转录因子PHO81锚蛋白重复序列表达和功能分析

酵母转录因子ＰＨＯ８１蛋白含有６个锚蛋白重复序列。将ＰＨＯ８１锚蛋白重复序列与谷胱甘肽转移酶（ＧＳＴ）融合表达（ＧＳＴ－ＡＮＫ）,表达产物以包含体形式存在。利用氧化型和还原型谷城肽系统对包含体进行复性,得到了可溶性蛋白,亲和纯化后,进行了活性分析。通过免疫共沉淀、分别制备了ＰＨＯ８５－ＰＨＯ８０和ＰＨＯ８５－ＰＡＰ１激酶复合物,用重组的ＰＨＯ４蛋白作底物,在激酶反应体系中加入ＧＳＴ－ＡＮＫ,发现它     

酵母PH02蛋白的磷酸化研究

本文报道ＰＨＯ２蛋白能被一种未知的蛋白激酶磷酸化ＰＨＯ２蛋白的第２３０－２３３位氨基酸残基组成一个可能被ｐ３４相关的蛋白激酶识别的一致序列（ＳＰＩＫ）,用点突变的方法将Ｓｅｒ－２３０变成Ａｌａ可导致ＰＨＯ２蛋白激活ＰＨＯ５表达能力的完全丧失。进一步的研究显示,将Ｐｒｏ－２３１突变成Ｓｅｒ同样可导致ＰＨＯ２的矢活,而Ｓｅｒ－２３０突变成Ａｓｐ则不影响ＰＨＯ２的活力。由于ＰＨＯ２（Ａｓｐ－２３０）突变体通过在第２３０位残基引入了一个负电荷,可以看成Ｓｅｒ－２３０被磷酸化的状态,由此推测ＰＨＯ２蛋白可能需要在Ｓｅｒ－２３０被磷酸化后才会具有激活ＰＨＯ５基因转录的能力。体外磷酸化分析的结果表明,大肠杆菌表达的ＧＳＴＩ－ＰＨＯ２（野生型）融合蛋白能够被酵母ＹＰＨ４９９总蛋白抽提物磷酸化,如果以ＳＰＩＫ（２３０－２３３）一致序列被破坏的ＧＳＴ－ＰＨＯ２（Ｐｒｏ－２３１→Ｓｅｒ）突变体作为底物,则观察不到该融合蛋白被酸磷化标记。结果表明ＰＨＯ２在细胞内是一种磷骏化蛋白,第２３０位Ｓｅｒ的磷酸化是该转录因子较制ＰＨＯ５基因表达的活性所必需。     

人白细胞介素—2第20位残基局部空间结构稳定性对活性的影响

用寡核苷酸诱导的基因定位突变法,将人白细胞介素－２（ＩＬ－２）第２０位Ａｓｐ分别突变为Ａｒｇ,Ｌｙｓ和Ａｓｎ,比较第２０位残基碱性基团对ＩＬ－２活力的影响,结果＾２０Ａｓｐ突变为碱性残基时,ＩＬ－２活性急剧下降,但突变为Ａｒｇ时所导致的活性下降较突变为Ｌｙｓ时所导致的活性下降较突变为Ｌｙｓ严重３０００倍以上。从空间结构变化上对这２个碱性残基造成的如此大的活性差异进行了分析,发现＾２０Ａｒｇ突变后对     

酵母PHO81蛋白的结构预测和功能分析

以Ｃｈｏｕ－Ｆａｓｍａｎ和ＧＯＲ方法预测酵母ＰＨＯ８１蛋白的二级结构。用Ｋｙｔｅ－Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ方法分析它的疏水性。分析了ＰＨＯ８１蛋白与其他蛋白的同源性,发现它包含５个ＳＷ１６／ＡＮＫ重复单位,这些重复单位可能是ＰＨＯ８１蛋白与负调控因子ＰＨＯ８０相互作用的位点。     

酵母PHO2蛋白的磷酸化研究

本文报道了ＰＨＯ２蛋白能被一种未知的蛋白激酶磷酸化。ＰＨＯ２蛋白的第２３０－２３３位氨基酸残基因组成一个可能ｐ３４＾ｃｄｃ３／ＣＤＣ２８相关的蛋白激酶识别的一致序列,用点突变的方法将Ｓｅｒ－２３０变成Ａｌａ可导致ＰＨＯ２蛋白激活ＰＨＯ５表达能力的完全丧失。     

PHO4和PHO2蛋白与PHO81基因调控序列的相互作用

高效表达产纯化了ＰＨＯ４和ＰＨＯ２蛋白,凝胶阻抑电泳分析证明了ＰＨＯ４和ＰＨＯ２蛋白与ＰＨＯ８１上游－４０１－２８９ｂｐ片段的结合,定点突变ＰＨＯ２的２３０位丝氨酸为天冬氨呈丙氨酸,不影响ＰＨＯ２蛋白与此片段的结合。足迹法分析证明了ＰＨＯ４结合在ＰＨＯ８１基因上游的３５４－３３３ｂｐ,ＰＨＯ２结合在３４１－３３４ｂｐ。因此,这些结果表明－４０１－２８９ｂｐ包含了ＰＨＯ８１的上游激活序列（ＵＡＳ）,     

大肠杆菌精氨酰－tRNA合成酶的Lys306为酶活力所必需

将大肠杆菌精氨酰ｔＲＮＡ合成酶（ＡｒｇＲＳ）上Ｌｙｓ３０６用基因点突变的方法分别变为Ａｌａ和Ａｒｇ的密码子;得到变种基因ａｒｇｓ３０６ＫＡ和ａｒｇｓ３０６ＫＲ。变种基因重组在ｐＵＣ１８上,转化到大肠杆菌ＴＧ１中,转化子中ＡｒｇＲＳ及其变种ＡｒｇＲＳ３０６ＫＡ和ＡｒｇＲＳ３０６ＫＲ所表达的蛋白量至少为ＴＧ１表达ＡｒｇＲＳ蛋白量的１００倍。细胞粗抽提液中ＡｒｇＲＳ的比活ＴＧ１、转化子ｐＵＣ１８－ａｒｇｓ、ｐＵＣ１８－ａｒｇｓ３０６ＫＡ和ｐＵＣ１８－ａｒｇｓ３０６ＫＲ分别为１．６５、２１０、１．８和３８单位／毫克。结果表明ＡｒｓＲＳ的Ｌｙｓ３０６为Ａｌａ取代使活力完全丧失;若被Ａｒｇ取代,则活力丧失８０％以上。Ｌｙｓ３０６为ＡｒｇＲＳ活力所必需。     

酵母转录因子PHO81基因的上游序列功能分析

利用ＰＨＯ８１ｌａｃＺ融合基因,对它的上游进行缺失分析,发现有两个区域对ＰＨＯ８１基因的表达是必需的：－４０１～－２８９ｂｐ和－１０１２～－８０１ｂｐ。比较ＰＨＯ８１和ＰＨＯ５,ＰＨＯ８４基因上游,未发现有较高同源性的序列存在,但在－４０１～－２８９ｂｐ区域有ＰＨＯ４蛋白结合位点的核心序列５′ＣＡＣＧＴＧ／Ｔ３′,以及ＣＡＣＧＴＧ／Ｔ两侧富含Ａ／Ｔ的序列（可能是ＰＨＯ２结合位点）。推测－４０１～－２８９ｂｐ包含了ＰＨＯ８１的上游激活序列（ＵＡＳ）,－１０１２～－８０１ｂｐ可能起增强的作用。用酵母总蛋白质对－１０１２～－８０１ｂｐ进行凝胶阻抑电泳分析,证明有未知的蛋白因子结合在这个区域。     

人血小板生成素 cDNA 合成、克隆及序列测定

利用ＲＴ－ＰＣＲ方法从中国人胎肝总ＲＮＡ中扩增出人血小板生成素（ｈＴＰＯ）的ｃＤＮＡ。序列分析结果表明,我们所获得的ｈＴＰＯ ｃＤＮＡ与献报道中的基因序列高度同源,其中第４９７ｂｐ、５９５ｂｐ、７６７ｂｐ和７９５ｂｐ位碱基分别由Ｔ、Ｇ、Ｔ和Ｔ代替了献中的Ｇ、Ａ、Ｇ和Ｃ,从而导致了１６６、１６９和２５６位氨基酸由报道中的Ｓｅｒ、Ｌｙｓ和Ｇｌｙ变为Ｐｈｅ、Ｇｌｕ和Ｖａｌ。     

人白细胞介素－2第20位残基局部空间结构稳定位对活性的影响

用寡核苷酸诱导的基因定位突变法,将人白细胞介素－２（ＩＬ－２）第２０位Ａｓｐ分别突变为Ａｒｇ、Ｌｙｓ．和Ａｓｎ,比较第２０位残基碱性基因对ＩＬ－２活力的影响,结果２０Ａｓｐ突变为碱性残基时,ＩＬ－２活性急剧下降,但突变为Ａｒｇ时所导致的活性下降较突变为Ｌｙｓ严重３０００倍以上,从空间结构变化上对这２个碱性残基造成的如此大的活性差异进行了分析,发现２０Ａｒｇ突变后对。１２１Ｔｒｐ的微环境有极为显著的影响。结果提示２０Ａｓｐ在与β亚基作用的同时,其局部空间结构的稳定对维持ＩＬ－２的生物学活性也有重要作用。     

抗天花粉蛋白单抗T8C12针对的抗原表位的判定

Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹结果表明抗天花粉蛋白（ＴＣＳ）单抗Ｔ８Ｃ１２能与ＣＮＢｒ裂解的ＴＣＳ片段结合,氨基酸组成分析显示该表位位于Ｎ端７２肽内。为进一步确定该表位的位置,用固定化的Ｔ８Ｃ１２对克隆于噬菌体Ｍ１３外壳蛋白ｐⅢ的随机六肽库进行了两轮亲和筛选后,随机测定了１５个阳性克隆的ＤＮＡ序列,发现插入的六肽序列有高度同源性,均含Ｓｅｒ／Ｔｈｒ－（Ｘ）－Ｘ－Ａｒｇ结果,Ｘ代表疏水氨基酸。这一结构与天花粉蛋     

蜈蚣碱性蛋白SSmp-d的分离纯化及其部分理化性质的鉴定

少棘巨蜈蚣（ＳｃｏｌｏｐｅｎｄｒａｓｕｂｓｐｉｎｉｐｅｓｍｕｔｉｌａｎｓＬ．Ｋｏｃｈ）经９５％乙醇脱脂后,再经４℃水冷渗,水提液低温旋转浓缩,冻干,得到的冻干粉先后经过ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－２５柱,等电聚焦制备电泳,再经ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－１５０柱,ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－１００柱,最后经ＨＰＬＣ制备得到一个纯的碱性蛋白,命名为ＳＳｍｐ－ｄ．该蛋白经ＨＰＬＣ、超薄等电聚焦电泳检验是均一的．采用ＨＰＬＣ和Ｐｒｏｔｅｉｎ－ＰａｋＴＭ１２５柱测定其分子量为２４．６４ｋＤ．ＩＥＦ－ＨＰＣＥ显示其等电点为９．２７．氨基酸分析表明ＳＳｍｐ－ｄ含较多的Ａｒｇ、Ｌｙｓ等碱性氨基酸,另外还含有较多的Ａｌａ、Ｌｅｕ．使用蛋白质自动序列分析仪测定了ＳＳｍｐ－ｄＮ端的１１个氨基酸,序列为ＮＨ３＋－Ａｓｐ－Ｖａｌ－Ａｓｎ－Ｐｈｅ－Ａｒｇ－Ｌｅｕ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ａｓｐ－Ｐｒｏ．     

人胰岛素原类似物(BKRA)基因的合成与表达

为了利用基因工程生产胰岛素,按照已知的人胰岛素Ａ、Ｂ链氨基酸序列和大肠杆菌偏爱的氨基酸密码子设计并合成了人胰岛素原类似物（ＢＫＲＡ）基因,其中以赖（Ｋ）－精（Ｒ）二肽编码区取代人胰岛素原Ｃ肽编码区．为了避免其编码蛋白在大肠杆菌中表达时被降解,通过人工接头将２个ＢＫＲＡ基因串联起来,接头部分氨基酸序列为Ａｒｇ－Ａｒｇ－Ａｓｎ－Ｓｅｒ．将串联的ＢＫＲＡ基因克隆到表达载体ｐＥＴ－２８ａ（＋）,实现了在大肠杆菌中的融合表达,表达产物以包含体形式存在,约占细菌总蛋白２４％．表达产物氨基末端具有六组氨酸肽段,以ＨｉＴｒａｐ凝胶进行亲和层析,一步纯化可达纯度９５％以上．放射免疫测定表明,纯化的融合蛋白具有胰岛素抗原活性．表明已构建成人胰岛素原类似物的高效表达菌株     

酵母PHO2与PHO4蛋白的激活活性的分析及两者的相互作用

ＰＨＯ２与ＰＨＯ４是酵母ＰＨＯ５基因的两个正调控因子,本文发现,ＰＨＯ２与酵母转录因子ＧＡＬ４的ＤＮＡ结合功能域融合后就能激活报道基因ｌａｃＺ的表达,其激活力受高低磷影响,表明ＰＨＯ２蛋白上存在酸性转录激活区。ＰＨＯ２蛋白上酸性氨基酸丰富的２８７－３２６肽段并非ＰＨＯ２的激活区。在ＰＨＯ２蛋白上２３０位Ｓｅｒ处于磷酸化状态２ＰＨＯ２才有激活作用,表明了这一磷酸化位点可能与ＰＨＯ２的转录激活能力有关     

人血小板生成素 cDNA 合成、克隆及序列测定

利用ＲＴ-ＰＣＲ方法从中国人胎肝总ＲＮＡ中扩增出人血小板生成素（ｈＴＰＯ）的ｃＤＮＡ。序列分析结果表明,我们所获得的ｈＴＰＯｃＤＮＡ与文献报道中的基因序列高度同源,其中第４９７ｂｐ、５９５ｂｐ、７６７ｂｐ和７９５ｂｐ位碱基分别由Ｔ、Ｇ、Ｔ和Ｔ代替了文献中的Ｇ、Ａ、Ｇ和Ｃ,从而导致了１６６、１９９和２５６位氨基酸由报道中的Ｓｅｒ、Ｌｙｓ和Ｇｌｙ变为Ｐｈｅ、Ｇｌｕ和Ｖａｌ。     

白细胞介素—2分子α螺旋B中的活性相关区域

根据人白细胞介素－２（ＩＬ－２）α螺旋Ｂ中氨基酸残基的空间分布选择性地突变了一些氨基酸残基,结果发现：５７Ｇｌｎ→Ｇｌｕ,６２Ｇｌｕ→Ｌｅｕ,６２Ｇｌｕ→Ａｒｇ和６５Ｐｒｏ→Ａｒｇ这些替换均使ＩＬ－２活性显著降低或丧失,而６３Ｌｅｕ→Ｓｅｒ或６４Ｌｙｓ→Ａｌａ对ＩＬ－２活性影响不大。从受体竞争抑制结合实验结果可知,上述不表现活性的突变体也同时丧夫了与高亲和力受体的结合能力,这说明α螺旋Ｂ中这些位点     

人组织型纤溶酶原激活剂（t—PA）突变体FrGGI的构建,表达及特性…

为了获得半衰期延长,特异活性提高及具有ＰＡＩ－１抗性的新型ｔ－ＰＡ溶性剂,利用基因重组及定位突变技术构建了ｔ－ＰＡ的Ｋ１、Ｋ２区糖基化位点消除,ＰＡＩ－１结合位点缺失,Ｆ与Ｅ区连接序列Ｈｉｓ４４￣Ｓｅｒ５０置换为纤粘蛋白Ｉ型Ｆ区间连接序列Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｇｌｕ的ｔ－ＰＡ组合突变体ＦｒＧＧＩ,并在中国仓鼠卵巢细胞中获得了高效表达,对表达产物的生物学特性分析表明     

应用实时BIA研究酵母PHO4和PHO2的相互作用

应用实时生物分子相互作用分析技术（ＢＩＡ）分析了酵母ＰＨＯ４和ＰＨＯ２蛋白的相互作用。将ＰＨＯ４蛋白通过氨基耦联在感应片上。进样５μｍｏｌ／Ｌ重组的谷胱甘肽转移酶融合的ＰＨＯ２蛋白（ＧＳＴ－ＰＨＯ２）及其两种突变体融合蛋白。结果表明ＰＨＯ２的２３０位丝氨酸变为天冬氨酸的突变体（ＧＳＴ－２ＳＤ）与ＰＨＯ４有强的表面等离子体激元共振信号,而生型ＰＨＯ２和２３０位丝氨酸变为丙氨酸的突变体（ＧＳＴ－２ＳＡ     

醇母PHO81基因的克隆和表达

从酵母染色体ＤＮＡ中获得１个约３．０ｋｂ的ＢａｍＨＩ的克隆片段和１个约５．０ｋｂ的ＰｓｔＩ片段,前者包含１７４５ｂｐ的ＰＨＯ８１基因编码序列及１２４４ｂｐ的上游序列,后者包含２２３６ｂｐ的编码序列及约２．８ｋｂ的下游序列,经拼接得到完整的ＰＨＯ８１基因。以ＵＲＡ３基因取代部分ＰＨＯ８１的编码序列,通过体内同源重组,获得ＰＨＯ８１基因缺陷的酵母细胞株。构建ＰＨＯ８１－ＬａｃＺ融合基因,以β－半乳糖苷酶的活力表示ＰＨＯ８１基因的表达水平,研究了它的表达作用。ＰＨＯ８１基因为阻遏型表达,受无机磷浓度的控制,高磷使基因表达阻遏,低磷去阻遏。ＰＨＯ８１对其自身的表达有正调控作用,它与ＰＨＯ５和ＰＨＯ１１基因的调控模式相似,但ＰＨＯ８１上游调控序列和ＰＨＯ５及ＰＨＯ１１的同源性很低。