人体膀胱移行细胞癌细胞系KGBC的建立及其生物学特性

本文报告建立了一株人膀胱移行细胞癌细胞系,命名为KGBC。KGBC细胞已在体外培养了10个月,传代65代。组织培养中,KGBC细胞形态为上皮样,呈单层或多层生长,接触抑制消失。光镜和电镜下,KGBC细胞的形态结构与膀胱移行细胞癌的形态结构相似。第27代和第42代细胞异种移植,能在小鼠体内生长,组织相与原发癌相似。第9代和第21代细胞的染色体数从65到190条,众数为90—95条。第35代细胞倍增时间为28小时。细胞经液氮保存,复苏良好。这些表明已建立了一株能在体外稳定生长的人膀胱癌细胞系。     

匙吻鲟鳍条组织细胞系的建立及其生物学特性

采用组织块移植培养技术,对来源于匙吻鲟鳍条组织的细胞进行原代培养,建立了匙吻鲟鳍条组织细胞系,已稳定传代培养80多代,定名为PF-Fin。匙吻鲟鳍条组织细胞的形态为成纤维样细胞,其最佳培养基为M199,最适血清浓度为10%,最适培养温度为25℃。液氮冷冻保存8个月后的细胞经台盼兰染色检验,约87.68%±3.61%仍保持活性,细胞复苏后培养生长旺盛。匙吻鲟鳍条组织细胞的集落形成效率为13.75%±2.28%;细胞染色体分析结果表明,第10代传代细胞的染色体数目为正常二倍体2n=120,第59代传代培养细胞的染色体众数为90。病毒敏感性试验结果表明,PF-Fin细胞对草鱼呼肠孤病毒(GCRV)、斑点叉尾鮰呼肠孤病毒(CCRV)和鲤鱼春季病毒血症病毒(SVCV)敏感,可产生典型细胞病变效应(CPE)。     

中华鲟组织培养的初步研究

取中华鲟的尾鳍、吻端、性腺等八种组织进行体外培养,得到来源于吻端和性腺组织的两个细胞株,分别命名为CSSn和CSG.CSSn和CSG均以成纤维样细胞为主。两种细胞都含有微染色体,染色体数目众多,在分布上具有“双峰多态”的特点,表明细胞已属异倍体。细胞生长较慢,CSG接种9d后、CSSn接种14d后数目达到最高值。CSG在16—30℃生长正常,最佳生长温度在27℃,最适pH为7.2。     

鼠脑微血管内皮细胞的分离与长期培养

采用胶原酶消化、差速离心、尼龙网滤过技术分离和获取鼠脑微血管内皮细胞,接种后4h换液使获得的内皮细胞纯化,体外进行长期培养。细胞在体外生长176天,传至30代,细胞初期成活率为92％,纯度近90％。经形态学、超微结构和免疫组化鉴定,培养细胞为血管内皮细胞。培养至第30代的细胞仍能合成和分泌PGI2、ACE等,ⅧF:Ag阳性表达,染色体为二倍体(2n=42),基本保持着细胞的主要特征。该分离和培养方法的建立,将为研究与脑血管相关疾病提供有用工具。     

锦鲤鳍条组织细胞系的建立及其生物学特性

采用组织块移植培养技术,对来源于锦鲤（Cryprinus carpiod）鳍条组织的细胞进行原代培养,建立了锦鲤鳍条组织细胞系,已稳定传代60多次,命名为Koi-Fin。锦鲤鳍条组织细胞为成纤维样细胞,最佳培养基为MEME,最适血清体积分数为10%,最适培养温度为25 oC,群体倍增时间为43.5 h。该细胞经液氮冷冻保藏12个月后采用台盼蓝染色,约（80.21±5.84）%的细胞具有细胞活性,复苏细胞生长旺盛。细胞染色体分析显示,第16代锦鲤鳍条组织细胞的染色体数目为正常二倍体2n=100,第40代细胞的染色体众数为52。病毒敏感性试验结果表明,Koi-Fin细胞系对锦鲤疱疹病毒（Koi Herpesvirus,KHV）敏感,可产生典型细胞病变效应,病毒滴度为107.86±0.51TCID50/mL。针对锦鲤疱疹病毒胸苷激酶（thymidine kinase,TK）基因设计特异性引物进行PCR检测,可扩增出病毒靶基因片段。     

条件性重编程人源肿瘤细胞初步研究

该研究利用条件性重编程技术培养来源于人肺癌、乳腺癌组织的原代细胞。细胞计数结果显示,利用条件性重编程技术可以在体外较短时间内获取大量细胞,并可在体外传代较长时间。制备培养的原代细胞的染色体标本并进行显带处理,结果显示,原代细胞的染色体为多倍体。STR分析结果显示,培养的细胞基本保留了其来源组织的分子遗传学特性。HE染色显示,培养的原代细胞中存在明显的多核仁以及明显的核分裂像。免疫组化结果显示,体外培养的原代细胞高表达CD44以及EpCAM,不表达ER、CK7等常见的表面标志物。体外悬浮培养、类器官培养以及流式细胞术结果表明,利用条件性重编程技术培养的原代细胞存在干细胞的特性。综上所述,利用条件性重编程技术可在短时间内在体外获得较多的原代肿瘤细胞,并且所获得的肿瘤细胞具有部分干细胞的特征。     

小白鼠S_(180)瘤细胞系的建立及其特征

S_(180)-V 系细胞,是通过悬浮静置培养过渡到单层静置培养而建成的。至今年6月已传至一百代。该系细胞形状不一,核大,常见单核或多核巨细胞。体外生长的细胞,约60%贴瓶生长,40%悬浮生长。悬浮生长的细胞,换瓶后仍能贴瓶生长。细胞群体倍增时间为14—20小时。分裂指数平均为35‰,分裂期的时长平均1.2小时。饱和密度约24×10~4/平方厘米。染色体众数值为88,具中双着丝点标记染色体。以10~6细胞/鼠的细胞数接种于小鼠,全部动物长成实体瘤或腹水瘤。     

树鼩视网膜微血管内皮细胞永生化细胞株的建立及鉴定

目的 建立树鼩视网膜来源的微血管内皮细胞的体外分离培养技术以及永生化细胞株，为体外利用树鼩视网膜微血管内皮细胞开展相关研究提供新的实验材料。方法 利用Ⅱ型胶原酶、分散酶和DNaseⅠ酶消化法分离培养出原代视网膜微血管内皮细胞，利用差速消化法纯化内皮细胞，然后利用携带SV40T基因的慢病毒转染细胞，再挑取单克隆后进行传代培养。对传至50代以上的细胞进行形态学观察、免疫荧光鉴定以及核型鉴定。结果 采用混合酶消化法能够分离获得微血管内皮细胞，纯化后的细胞呈不规则多角形和梭形。经慢病毒转染后的细胞传代培养后细胞形态一致，到第50代时细胞形态结构仍较好。细胞免疫荧光结果显示标志性蛋白VWF、CD34、Claudin1、ZO-1和永生化SV40T表达阳性。生长曲线结果显示：细胞生长旺盛，第2～4天时处于对数生长期，第4天进入平台期。细胞核型结果显示：染色体数与树鼩染色体相同，即所获取的细胞为永生化的树鼩视网膜微血管内皮细胞。结论 成功建立的树鼩视网膜微血管内皮细胞永生化细胞株具有较好的形态结构与功能，为视网膜病变及眼科相关疾病的研究提供了新的实验材料。     

西伯利亚狍成纤维细胞建系及其生物学特性分析北大核心CSCD

本研究以内蒙古大青山获得野生雄性和雌性西伯利亚狍(Capreolus pygargus)为实验材料,利用组织块贴壁培养法进行气管、肺和耳3种组织成纤维细胞原代建系,研究不同组织来源的细胞贴壁率、冷冻前及复苏后存活率、生长曲线,进一步绘制狍成纤维细胞核型图并分析其G带特征。实验结果显示,气管、肺和耳3种组织成纤维细胞增殖经历潜伏期、对数生长期、平台期三个阶段,细胞形态为梭形、三角形或不规则形,是典型成纤维细胞形态;成纤维细胞呈漩涡状生长,其中气管、耳成纤维细胞生长增殖能力最强、肺成纤维细胞增殖能力较弱,气管和耳组织来源成纤维细胞呈典型“S”型细胞生长特征。染色体核型及G带分析结果显示,雄性狍成纤维细胞染色体条数为2n=70,其中,有34对常染色体,形态类型为12条近端着丝粒染色体(st),22条亚中着丝粒染色体(sm),1对性染色体,X染色体为中着丝粒染色体(m),Y染色体为近端着丝粒染色体(st),5条超数染色体(B);雌性狍成纤维细胞染色体条数为2n=70,其中,有34对常染色体,其形态类型为29条亚中着丝粒染色体(sm),5条近端着丝粒染色体(st),1对为性染色体,X染色体为亚中着丝粒染色体(sm),8条超数染色体(B)。本研究成功建立了雄性和雌性西伯利亚狍气管、肺和耳3种组织来源的成纤维细胞系,在体外培养时生长状态良好且维持了细胞的遗传信息稳定性,绘制了西伯利亚狍雄性和雌性染色体核型及G带图谱,为将来更深入开展相关研究提供材料与基本技术支撑。     

牛胎儿成纤维细胞的组织块贴附法分离培养与电穿孔法基因转染

为获得转基因克隆牛的供体细胞,采用组织块贴附培养的方法分离培养牛胎儿皮肤成纤维细胞,经2～3次传代纯化,绘制生长曲线,分别分析体外传代培养10代以内和20代以上细胞的核型特征。分别采用800、900、1000V／cm和1、5、10、15和20ms的参数组合,将线性化的带有新霉素抗性和绿色荧光蛋白双重筛选标记的人胰岛素原乳腺特异表达载体pNEI电穿孔转入体外培养的牛胎儿成纤维细胞,经800μg／mLG418筛选2周,继续以300μg／mLG418扩大培养2～3代,取部分筛选后的细胞进行PCR检测结果表明,体外培养的牛胎儿成纤维细胞生长旺盛,体外传代20次后核型未发生改变;转染后24～48h在荧光镜下检测各组均可观察到绿色荧光表达,筛选后各组克隆形成数以900V／cm和5ms组最多;PCR检测得到了预期条带,说明目的基因已经成功导入。分离得到的牛胎儿耳成纤维细胞有可能作为体细胞核移植的供体,进行转基因克隆研究。     

血清饥饿、汇合培养及放线菌酮对奶牛成纤维细胞周期的影响

在动物克隆研究中,研究者普遍认为位于细胞周期的G0+G1期的二倍体细胞对于核移植中供核细胞的重新程序化是必需的。本文探讨了血清饥饿、汇合培养及放线菌酮（CHX）处理对不同传代次数的体外培养奶牛成纤维细胞周期分布的影响。流式细胞仪分析结果显示：第3代和第13代细胞经血清饥饿处理72h后,细胞周期分布与对照差异显著(P<0.05);汇合培养可以显著增加奶牛成纤维细胞处于G0+G1期细胞数。CHX处理第3代细胞经CHX处理后处于G0+G1期的细胞数差异不显著,而第13代细胞处理后差异显著。结果表明体外培养奶牛成纤维细胞高代对血清饥饿、汇合培养及CHX处理更敏感。     

藏羚羊成纤维细胞系的建立及其核型分析

藏羚羊(Pantholops hodgsonii)是我国特有的国家Ⅰ级重点保护野生动物,生存在高海拔低氧环境下,具有高原生物的细胞遗传特性。实验采用组织块贴壁培养法进行原代培养,后经差异贴壁法联合消化排除法纯化,成功构建了藏羚羊成纤维细胞系,并对培养不同代次细胞的形态、生长动力学、染色体核型等进行了研究。结果表明,培养得到的藏羚羊细胞为典型的成纤维细胞,第7、10、15代细胞群体倍增时间分别为26、48、50 h。细胞的生长均为"S"型。染色体中二倍体染色体(2n=60)占主体,所占比例为65%～91%,包括性染色体X、Y在内均为端着丝粒类型,染色体组的总相对长度为193.45,平均相对长度为3.22,未发现随体、次缢痕等特殊标志性特征。     

豹猫体细胞建系及其生物学特性分析

研究体外培养豹猫(Prionailurus bengalensis)细胞的形态、细胞贴壁率、冷冻存活率、生长曲线及细胞核型等生物学特性,为深入开展豹猫基因组学及濒危野生动物保护提供依据。本实验选择豹猫3种组织,即剑状软骨、心和肺,采用组织块贴壁培养法进行体细胞的原代培养;酶消化法完成细胞的传代培养;程序降温完成细胞的冷冻保存;通过细胞计数法计数细胞冷冻存活率;绘制细胞生长曲线;采用常规染色体标本制备技术,对豹猫的染色体核型及G带进行分析。细胞原代培养结果显示,剑状软骨组织在培养第3天出现纤维样细胞、培养6~7 d铺满培养瓶;心组织在培养第5天出现上皮样细胞、12 d铺满培养瓶;肺组织在培养4 d后出现成纤维细胞、8~9 d铺满培养瓶。3种来源体细胞均显示成纤维细胞特征,剑状软骨源细胞最易贴壁、肺源细胞次之、心源细胞最弱。对比3种不同来源体细胞从6代(P6)至12代(P12)冷冻存活率,剑状软骨源细胞冷冻存活率显著下降(冻存前91.0%~97.6%,冻存后76.8%~85.5%,P0.05),心源细胞冷冻存活率亦显著下降(冻存前82.7%~88.1%,冻存后43.7%~80.5%,P0.05),肺源细胞冷冻存活率有下降趋势,但无显著差异(冻存前83.4%~96.8%,冻存后73.9%~93.3%,P0.05)。生长曲线分析显示,3种体细胞均呈"S"型,其中剑状软骨源细胞增殖最快、肺源细胞次之、心源细胞最慢。核型分析结果显示,3种不同来源的成纤维体细胞染色体数目均为2n=38,18对为常染色体,形态类型为6m+10sm+2st,1对为性染色体,X染色体形态类型为m。本研究建立了3种组织来源的豹猫成纤维细胞建系技术及体细胞系,揭示了该物种成纤维细胞的基本生物学特性,为动物遗传信息研究及豹猫保护提供了重要的实验材料和基础信息。     

分步消化法原代培养鼠阴道黏膜上皮细胞的研究

目的探讨大鼠阴道黏膜上皮细胞的体外培养和扩增技术,为构建组织工程化阴道动物模型提供种子细胞。方法取大鼠阴道全层组织,经Dispase酶和胰酶分步消化后,接种于无血清角化细胞培养液中连续培养,观察细胞形态、体外生长特性和超微结构,绘制生长曲线,免疫组化鉴定。结果原代细胞培养24-36 h后开始贴壁,7-10d约80%融合,呈铺路石样外观,可连续传5-6代;扫描电镜下细胞表面可见微绒毛嵴;角蛋白染色阳性,细胞纯度98%;第五代细胞为正常二倍体核型。结论该方法培养的阴道上皮细胞增殖状态良好,细胞纯度高,扩增迅速,可在较短时间内获得大量细胞用于组织工程学研究。     

牛肝脏细胞体外培养和传代细胞的初步鉴定

该文采用灌注胶原酶消化法分离牛肝细胞,通过DMEM培养基(含10%胎牛血清)体外连续进行原代和传代培养,观察细胞增殖变化及细胞培养过程中的形态消涨变化情况。该文还对第12代培养细胞的染色体情况及细胞生长情况进行分析,同时采用PAS染色法进行糖原含量鉴定。结果显示,分离的肝细胞群体倍增时间为62.8 h,染色体为60条, PAS染色观察发现,培养细胞质中有大量糖原颗粒。     

人类脂肪来源成体干细胞体外培养的生物学特征研究及供体年龄对其增殖的影响

通过研究人类脂肪组织来源成体干细胞(human adipose tissue derived adult stem cells, hADAS细胞)体外培养的生物学特征及供体年龄对其生长增殖的影响, 为其作为组织工程学研究和应用的种子细胞提供实验室研究基础. 取不同年龄组志愿者(<20岁、21~40岁、41~60岁和>61岁), 手术中切除少量皮下脂肪组织, 酶消化法分离细胞, 体外培养, 传至20代. 取培养第3代细胞, 流式细胞仪检测细胞表面抗原标记物(CD29, CD34, CD44, CD45, CD49d, HLA-DR, CD106)和细胞周期. 细胞培养传20代后进行细胞染色体组分析. MTT法分别检测各年龄组不同时间点吸光值, 绘制生长曲线, 根据公式换算人类脂肪来源干细胞倍增时间(time doubling, TD). 结果显示: 酶消化法自皮下脂肪组织分离细胞, 体外培养hADAS细胞, 流式细胞仪检测示CD29+, CD34-, CD44+, CD45-, CD49d±, HLA-DR-, CD106-; G1期占90%(P10代); P20细胞染色体组分析显示为正常染色体, 未见异常染色体, 保持遗传稳定. 绘制细胞生长曲线, <20年龄组TD为(11.22±0.73)h, 21~40年龄组TD为(11.14±0.76)h, 两组之间P >0.05, 无显著性差异; 41~60年龄组TD为(13.18±1.58)h , >61年龄组TD为(13.11±0.83)h, 两组之间P>0.05, 无显著性差异. <20年龄组TD与>61年龄组TD显著性差异, P<0.05. 说明hADAS细胞可方便地取材于皮下脂肪组织, 体外培养遗传特性稳定, 生长活跃, 青年组生长活性强于老年组, 可以作为组织工程学种子细胞的新来源.     

增强型绿色荧光蛋白标记兔间充质干细胞体外复合小肠黏膜下层的生长特性

目的利用绿色荧光蛋白（EGFP）标记兔来源的骨髓间充质干细胞（BMSC）,观察其作为种子细胞复合SIS基质体外培养的生长特性,为复合物回植体内时间提供参考。方法通过物理和化学方法制备小肠黏膜下层（SIS）;取新西兰大白兔分离BMSC,体外培养增殖至P3代,行转染增强型EGFP,转染前后根据增殖速度,绘制生长曲线。然后将转染后的第3代间BMSC,以30×106的浓度接种于1 cm×1 cm大小的SIS支架材料上培养。观察细胞转染后的生长特性,检测复合后的细胞总数,荧光显微镜观察复合后细胞形态。结果 BMSC经转染后生长增殖速度未受明显影响。细胞DNA检测显示复合物培养第7天培养结果显示细胞增殖状态最佳差异有统计学意义（P〈0.05）。荧光显微镜观察显示复合物培养7天细胞增殖良好差异有统计学意义（P〈0.05）,第10天后呈现老化状态。结论增强型的EGFP转染不影响间充质干细胞传代以及增殖。间充质干细胞-SIS基质复合物体外培养7 d回植较为合适。     

深低温冻存组织工程化软骨在喉狭窄功能重建中的应用

目的：探讨低温保存组织工程化软骨在喉狭窄功能重建中的应用价值。方法：取3周龄新西兰兔关节软骨细胞,体外培养,取第2代对数生长期培养细胞,制成细胞悬液,调整软骨细胞悬液浓度约为5×10^7个／ml左右,接种于PGA三维支架材料上,复合物体外培养2周后冻存,冻存6个月后解冻复苏,再行体外培养观察,2周后接种于已建立的喉甲状软骨缺损模型的软骨缺损处,并设对照组。术后12周取材,行大体及组织学观察。结果：经低温冻存的组织工程化软骨生长良好,组织学观察有软骨形成,与周围软骨组织结合紧密,与非冻存组相比差异无统计学意义。结论：深低温冻存对组织工程化软骨的生物活性无明显的影响,低温冻存的组织工程化软骨可用于喉软骨缺损的修复,重建喉功能。     

深低温冻存组织工程化软骨在喉狭窄功能重建中的应用

目的:探讨低温保存组织工程化软骨在喉狭窄功能重建中的应用价值。方法:取3周龄新西兰兔关节软骨细胞,体外培养,取第2代对数生长期培养细胞,制成细胞悬液,调整软骨细胞悬液浓度约为5×107个/ml左右,接种于PGA三维支架材料上,复合物体外培养2周后冻存,冻存6个月后解冻复苏,再行体外培养观察,2周后接种于已建立的喉甲状软骨缺损模型的软骨缺损处,并设对照组。术后12周取材,行大体及组织学观察。结果:经低温冻存的组织工程化软骨生长良好,组织学观察有软骨形成,与周围软骨组织结合紧密,与非冻存组相比差异无统计学意义。结论:深低温冻存对组织工程化软骨的生物活性无明显的影响,低温冻存的组织工程化软骨可用于喉软骨缺损的修复,重建喉功能。     

单纯疱疹病毒Ⅱ型使人胚肺细胞转化的实验研究

用紫外线灭活的单纯疱疹病毒Ⅱ型使人胚肺细胞发生转化,获得三系转化细胞。转化细胞呈多角形,似上皮细胞。细胞形态符合瘤细胞特征。细胞染色体数目明显增多,呈超二倍体型。体外培养时,细胞长满单层后极易堆集重叠生长成锥体细胞群,提示细胞的生长接触抑制消失。用间接免疫酶试验证实转化细胞内存在HSV特异抗原。HSV抗原在第51代转化细胞内仍持续存在。