草鱼TRIM32基因克隆表达及功能研究

TRIM (Tripartite-motif protein) 家族是机体先天性免疫的重要成员, 参与细胞增殖分化、细胞凋亡、肿瘤抑制、抗病毒等过程。为了进一步探究TRIM蛋白在鱼类免疫中的作用, 实验利用PCR方法克隆了草鱼TRIM32基因的编码区全长, 共1980 bp, 编码660个氨基酸。草鱼TRIM32具有TRIM家族典型的3个结构域, 与斑马鱼TRIM32的核苷酸序列同源性较高, 遗传进化分析也聚为一支。间接免疫荧光、Western-blotting检测结果显示草鱼TRIM32在EPC细胞中成功表达, 主要以点状分布在细胞质中, 细胞核中表达量较少; 组织分布分析表明TRIM32在被检测的11个组织中均有表达, 其中在头肾组织中的表达量明显高于其他组织; 不同胚胎发育时期的表达分析进一步表明, TRIM32在受精卵时期、卵裂期和囊胚期的表达量显著高于其他时期(P<0.05), 随后表达量下降, 直到出膜后表达量再次显著性升高。此外, 双荧光素酶检测系统显示TRIM32能够激活NF-κB信号通路, 诱导下游的炎症反应。结果显示, 草鱼TRIM32广泛分布于鱼体内, 并参与机体的天然免疫反应, 对于抵抗病原体的入侵具有重要作用。     

池养条件下似刺鳊(鱼句)早期发育阶段的摄食与生长特性

对人工培育的似刺鳊(鱼句)(Paracanthobrama guichenoti)仔鱼、稚鱼和幼鱼的生长与摄食节律进行了研究.结果显示,在1~70日龄间,似刺鳊(鱼句)全长平均日增长率为3.55%,体重平均日增长率为11.26%,头长/全长值随着13龄的增长而变小.全长(L,mm)与体重(M,mg)的关系式为M=0.001 2 L2-0.056 4L+0.650 4;体重(M,mg)与日龄(D,d)的关系式为M=0.004 3 e0.0936D;全长(L,mm)和日龄(D,d)的关系式为L=0.015 4 D2-0.012 8 D+8.196 5.在饵料充足的条件下,20日龄晚期仔鱼全天均有很高的摄食发生率,小高峰出现在8:00时;40日龄稚鱼则表现出明显的昼夜摄食节律,属于典型的白天摄食类型,日摄食率2.337 6%.20 13龄仔鱼和40日龄稚鱼饱食后分别经6 h、5 h整个消化道排空.在水温25℃及饥饿空胃状态下,10日龄仔鱼只经3 d即开始出现死亡个体,经5 d全部死亡;20日龄仔鱼经6 d开始出现死亡个体,经9 d全部死亡;40 13龄稚鱼经7 d才开始出现死亡个体,10 d后全部个体均死亡.     

锦鲤鳍条组织细胞系的建立及其生物学特性

采用组织块移植培养技术,对来源于锦鲤（Cryprinus carpiod）鳍条组织的细胞进行原代培养,建立了锦鲤鳍条组织细胞系,已稳定传代60多次,命名为Koi-Fin。锦鲤鳍条组织细胞为成纤维样细胞,最佳培养基为MEME,最适血清体积分数为10%,最适培养温度为25 oC,群体倍增时间为43.5 h。该细胞经液氮冷冻保藏12个月后采用台盼蓝染色,约（80.21±5.84）%的细胞具有细胞活性,复苏细胞生长旺盛。细胞染色体分析显示,第16代锦鲤鳍条组织细胞的染色体数目为正常二倍体2n=100,第40代细胞的染色体众数为52。病毒敏感性试验结果表明,Koi-Fin细胞系对锦鲤疱疹病毒（Koi Herpesvirus,KHV）敏感,可产生典型细胞病变效应,病毒滴度为107.86±0.51TCID50/mL。针对锦鲤疱疹病毒胸苷激酶（thymidine kinase,TK）基因设计特异性引物进行PCR检测,可扩增出病毒靶基因片段。     

温度对花斑副沙鳅仔鱼发育、摄食及不可逆点的影响

2011年4～5月,研究了温度对花斑副沙鳅(Parabotia fasciata)早期仔鱼的发育、初次摄食时间、群体摄食率及不可逆点(PNR)的影响。结果发现,花斑副沙鳅仔鱼出膜后2 d已开始摄食;初次群体摄食率最高值出现在卵黄囊耗尽后的1～2 d,花斑副沙鳅仔鱼的摄食强度随温度升高而增大。仔鱼抵达PNR的时间随温度升高而缩短:22℃时,仔鱼的PNR出现在出膜后的8.0～9.0 d;26℃时,PNR为7.0 d;28℃时,PNR为5.5 d;30℃时,PNR为5.0 d。最大初次摄食率至PNR之间为不可逆饥饿期,22℃时为3.5 d,30℃时仅为1.5 d,说明温度越高,仔鱼耐受饥饿的能力越差,越不利于仔鱼的存活。研究认为,温度对花斑副沙鳅仔鱼发育、摄食及不可逆点的影响较大;在苗种培育过程中,应根据温度确定投饵时间,适时投饵对仔鱼的成活显得尤其重要。     

HIV-1缺损慢病毒载体的高滴度制备及其介导的高效基因转移

近来,慢病毒载体引起了极大关注,己成为转基因操作中重要的工具。用编码病毒组份的三质粒系统共转染293T包装细胞系,建立了大量制备HIV-1缺损慢病毒载体的方法,病毒载体的度可达到1.1×107IU/mL,离心浓缩可将载体滴度提高100倍以上。HIV-1缺损慢病毒载体可以高效转导人淋巴瘤等多种来源的细胞,RT-PCR检测显示外源基因GFP稳定表达达18个月以上,长期传代观测未检出p24抗原蛋白或可复制病毒。     

鲤疱疹病毒II型ORF25B编码蛋白诱饵载体的构建及其互作蛋白的筛选

【目的】鲤疱疹病毒Ⅱ型(Cyprinid herpesvirus 2,CyHV-2)感染养殖鲫引起的鲫造血器官坏死病,给鲫养殖业造成了重大的经济损失。揭示CyHV-2感染宿主细胞的机制,是建立鲫造血器官坏死病有效防治技术的重要基础。【方法】本研究针对CyHV-2富含抗原表位的ORF25B区域设计引物,扩增ORF25B基因截短序列。将扩增产物克隆至酵母双杂交诱饵载体pGBKT7,构建诱饵载体pGBKT7-tORF25B,转化至酵母菌株Y2HGold中。在营养缺陷型培养基上,验证诱饵表达载体pGBKT7-tORF25B对酵母菌Y2HGold自激活现象和毒性作用。利用酵母双杂交技术,将诱饵菌株pGBKT7-tORF25B/Y2HGold与鲫脑组织细胞系(GiCB)cDNA文库杂交。【结果】ORF25B基因截短序列扩增大小约为981 bp,成功构建了诱饵菌株pGBKT7-tORF25B/Y2H Gold,自激活和毒性验证结果表明,诱饵表达载体对酵母菌株无自激活现象,也无毒性作用,初步筛选出4种与tORF25B基因编码蛋白互作的宿主蛋白。【结论】本研究结果为深入开展CyHV-2 ORF25B编码蛋白功能及病毒入侵宿主细胞的机制研究奠定了重要基础。     

池养条件下似刺鳊鮈早期发育阶段的摄食与生长特性

对人工培育的似刺鳊鮈（Paracanthobrama guichenoti）仔鱼、稚鱼和幼鱼的生长与摄食节律进行了研究。结果显示,在1～70日龄间,似刺鳊鮈全长平均日增长率为3．55％,体重平均日增长率为11．26％,头长／全长值随着日龄的增长而变小。全长（L,mm）与体重（M,mg）的关系式为M=O．0012L^2-0．0564L＋0．6504;体重（M,mg）与日龄（D,d）的关系式为M=O．0043e^0.0936D;全长（L,mm）和日龄（D,d）的关系式为L=0．0154D^2-0．0128D＋8．1965。在饵料充足的条件下,20日龄晚期仔鱼全天均有很高的摄食发生率,小高峰出现在8：00时;40日龄稚鱼则表现出明显的昼夜摄食节律,属于典型的白天摄食类型,日摄食率2．3376％。20日龄仔鱼和4013龄稚鱼饱食后分别经6h、5h整个消化道排空。在水温25℃及饥饿空胃状态下,10日龄仔鱼只经3d即开始出现死亡个体,经5d全部死亡;20日龄仔鱼经6d开始出现死亡个体,经9d全部死亡;40日龄稚鱼经7d才开始出现死亡个体,10d后全部个体均死亡。     

患病大鲵中弗氏柠檬酸杆菌的分离与鉴定

【目的】确定导致大鲵(Andrias davidianus)细菌性感染死亡的病原。【方法】从大鲵肝脏中分离细菌,通过Biolog微生物自动鉴定系统及分子生物学方法对纯培养的细菌进行鉴定,再用大鲵和鲫鱼分别进行人工感染试验,以确定分离菌的致病性,同时对分离到的病原菌进行药物敏感试验。【结果】从患病大鲵肝脏中分离到一株致病菌JZ01,经人工感染健康大鲵,可复制与自然发病相同的症状,且从人工感染病鲵体内再次分离到相同的病原菌。该致病菌对健康鲫鱼也有致病性。经Biolog微生物自动鉴定系统的鉴定,以及进一步的16S rDNA基因序列和系统发育分析都表明,此致病菌为弗氏柠檬酸杆菌。药物敏感性试验表明,该菌株对氨曲南、头孢三嗪、先锋噻肟等9种药物高度敏感。【结论】弗氏柠檬酸杆菌是大鲵的一种致病菌。本文在国内外首次报道了该菌对大鲵具有致病性。     

基于暴露分析与关键控制点方法对医院开展严重急性呼吸综合征冠状病毒2型检测的可行性研究

评估2019新型冠状病毒病暴发期间在医院开展严重急性呼吸综合征冠状病毒 2 型(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2)核酸检测的可行性,为最终在医院开展核酸检测提供参考。熟悉暴露分析和关键点控制(exposure analysis and critical control points,EACCP)工作框架的专业人员在基于医院现实条件下,对SARS-CoV-2检测过程中可能的感染暴露风险和途径进行梳理,建立整个检测流程,验证在配备有发热门诊的医院开展的可行性,并明确降低暴露风险的关键控制点。高风险是在发热门诊标本的采集和灭活处理,中风险是未灭活标本的储运,低风险是灭活标本的储运和检测。优化检验流程能降低检测过程中感染暴露风险,对于高风险的操作,可在生物安全二级实验室(发热门诊或移动采集点等)和相应的安全防护等级下进行操作; EACCP分析方法可用于新发感染性疾病暴发期间的管理。