以分子信标为报告分子的凝血酶检测新方法

以分子信标为报告分子,核酸适体为识别分子,发展了一种新的凝血酶检测方法.含有分子信标互补序列的核酸适体探针与凝血酶结合后,分子信标的荧光信号下降,从而得到凝血酶的浓度信息.该方法快速、灵敏,核酸适体探针无需荧光标记、设计简单,检测限达到0.83nmol/L.     

双链探针实时荧光PCR核酸检测新技术研究*

目的:采用一种“双链探针”实时荧光PCR技术,提高HBV核酸检测灵敏度,并在同一反应管中实现代谢酶CYP2C19^*2基因型检测。方法:采用双链探针与TaqMan探针同时检测不同浓度HBV血清样本,使用上海宏石SLAN 96实时荧光PCR仪进行核酸Ct值检测和结果统计分析;采用双链探针检测代谢酶CYP2C19^*2不同基因型样本,使用上海宏石SLAN 96实时荧光PCR仪进行核酸Ct值检测和基因型确定。结果:不同浓度HBV血清样本检测,双链探针荧光本底低,检测灵敏度更高,与TaqMan探针检测结果相比,两者核酸检测Ct值存在显著性差异(P<0.05);双链探针检测36份样本的代谢酶CYP2C19^*2基因型,检测结果与Sanger测序结果完全一致。结论:双链探针实时荧光PCR检测技术可完成目的基因的高灵敏核酸检测,也可实现基因型分析。     

TaqMan荧光定量RT-PCR检测水稻RAc1基因mRNA方法的建立

构建包含RAc1基因cDNA片段的质粒,作为水稻肌动蛋白基因RAc1之mRNA定量检测的标准品,建立检测方法,为水稻其他基因的定量建立内参.从水稻叶总RNA中逆转录扩增总cDNA,PCR扩增RAc1基因中设计的目的片段,将纯化的目的片段与pMD19-T Simple载体进行连接,转化宿主菌JM-109,提取重组质粒DNA,PCR鉴定并测序分析.纯化质粒并检测260nm吸光值,确定重组质粒原液的拷贝浓度并以此制备荧光定量PCR梯度浓度标准品,进行实时荧光定量PCR实验.建立了RAc1基因mRNA表达实时荧光定量PCR检测方法,特异性好,检测灵敏度达102拷贝,线性范围为102～107拷贝,阈值循环数(Ct)与PCR体系中起始模板量的对数值之间有着良好的线性关系(r=1.000),扩增效率高(E=98.2%).建立了基因RAc1实时定量PCR的质粒标准品.     

TaqMan荧光定量RT-PCR检测水稻RAcl基因mRNA方法的建立

构建包含RAcl基因cDNA片段的质粒,作为水稻肌动蛋白基因RAcl之mRNA定量检测的标准品,建立检测方法,为水稻其他基因的定量建立内参。从水稻叶总RNA中逆转录扩增总cDNA,PCR扩增RAcl基因中设计的目的片段,将纯化的目的片段与pMD19-T Simple载体进行连接,转化宿主菌JM-109,提取重组质粒DNA,PCR鉴定并测序分析。纯化质粒并检测260nm吸光值,确定重组质粒原液的拷贝浓度并以此制备荧光定量PCR梯度浓度标准品,进行实时荧光定量PCR实验。建立了RAcl基因mRNA表达实时荧光定量PCR检测方法,特异性好,检测灵敏度达102拷贝,线性范围为102—1护拷贝,阈值循环数（Ct）与PCR体系中起始模板量的对数值之间有着良好的线性关系（r=1．000）,扩增效率高（E=98．2％）。建立了基因RAcl实时定量PCR的质粒标准品。     

实时荧光定量TaqMan-MGB探针法检测杆菌样巴尔通体

【目的】应用Taq Man探针实时荧光定量PCR技术建立特异性强、敏感性高和稳定性好的快速杆菌样巴尔通体检测方法。【方法】应用生物信息学方法查找杆菌样巴尔通体特有基因,从中筛选出一段特有的基因序列为模板设计探针和引物。通过比较Ct值和荧光强度确定扩增反应的最佳退火温度、探针和引物浓度;将扩增产物连接到p EASY-T载体上制备标准品,绘制标准曲线,分析扩增效率和线性关系;评估方法的特异性、敏感性及重复性。【结果】优化后退火温度为60°C,探针和引物浓度均为200 nmol/L,反应体系20μL。特异性实验显示只有杆菌样巴尔通体扩增出荧光信号,其他种属细菌均未见荧光信号;标准曲线线性关系良好(R2=1),扩增效率E=98.18%;最低检出限为每个PCR反应3个拷贝;组内和组间的变异系数CV值分别为0.21%–0.42%和0.29%–0.59%,在允许范围内。【结论】研究建立的实时荧光定量Taq Man-MGB探针法特异性强、灵敏度高、稳定性好,可快速检测鉴定杆菌样巴尔通体,为这种巴尔通体所引起的一系列疾病的早期快速诊断、监测和流行病学调查等研究提供有效手段。     

美国白蛾核型多角体病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

为了建立对昆虫核型多角体病毒（nucleopolyhedrovirus）进行定量检测方法,本研究选用美国白蛾Hyphantria cunea核型多角体病毒的polyhedrin基因为目的基因,经引物设计、PCR 扩增、目的片段与载体连接转化以及重组质粒的鉴定,并对重组质粒标准品和样品DNA进行检测,构建出美国白蛾核型多角体病毒SYBR GreenⅠ荧光定量标准曲线。统计学分析显示标准品浓度的对数值与Ct 值之间存在良好的线性关系（R=0.998）。该方法的检测灵敏度为10¹～10²拷贝/μL,线性范围达5个数量级,扩增产物形成单一的特异性熔解峰,组内组间的变异系数均小于3%。根据已建立的方法对不同感染时间段的感病幼虫进行检测,每毫克幼虫样本内病毒polyhedrin基因拷贝数增殖倍数对数值与感染时间（d）呈正相关（R=0.987）。这些结果表明,建立的美国白蛾核型多角体病毒荧光定量 PCR检测方法是可靠的,具有灵敏度高、重复性好等特点,可为昆虫核型多角体病毒体内增殖动态研究及昆虫病毒的标准化生产提供参考。     

枣疯病植原体实时荧光定量PCR检测方法的研究

目的:建立枣疯病植原体拷贝数检测实时荧光定量PCR方法,为枣疯病植原体定量检测提供技术支持。方法:构建质粒标准品,设计实时荧光PCR探针引物,优化体系,建立标准曲线,并进行重复性验证。结果:制备了枣疯病植原体标准质粒,建立了稳定的质粒标准品检测体系(R2=0.998,检测限10拷贝,定量限100拷贝)。结论:实时荧光定量PCR检测方法重复性好,可用于枣疯病植原体的拷贝数检测,为枣疯病植原体检验检测和病害防治提供了技术支持。     

基于核酸适体和胶体金技术构建凝血酶的DNA逻辑门

DNA逻辑门在分子计算机和分子水平上的计算技术中具有重要作用。我们通过设计核酸适体与凝血酶特异结合导致胶体金团聚的方法,构建了凝血酶的DNA逻辑门。凝血酶作为输入信号与其核酸适体结合,将监测探针上的胶体金结合位点释放,两个核酸功能化修饰的胶体金同时结合到监测探针上,引起胶体金团聚,实现信号输出。根据这个设计原理,成功构建了蛋白质凝血酶的YES逻辑门。     

版纳微型猪近交系TNF-α基因mRNA实时荧光定量PCR检测方法的建立

目的快速、灵敏、可靠的检测与临床多种疾病密切相关的重要基因TNF-α的表达情况,构建TNF-α基因及内参GAPDH基因荧光定量PCR质粒标准品。方法利用版纳微型猪近交系4～6月龄猪建立动物模型,提取皮肤创面总RNA,设计特异引物,进行RT-PCR扩增。纯化目的片段与pMD18-T载体连接,转化宿主菌DH5α,提取重组质粒DNA,并经酶切、PCR和测序鉴定,计算重组质粒原液拷贝数浓度并制备梯度浓度标准品,进行实时荧光定量PCR,生成标准曲线。结果建立的TNF-α基因和GAPDH内参基因mRNA表达实时荧光定量PCR检测方法灵敏度分别可达103和105拷贝,线性范围分别为103～109和105～109拷贝,阈值循环数(Ct)与PCR体系中起始模板量的对数值之间存在的线性关系R2分别为0.993和0.999,扩增效率E分别为111.073%和95.948%。结论成功的构建了版纳微型猪近交系TNF-α基因质粒标准品和标准曲线,并用内参基因GAPDH进行校正,此方法可为探讨TNF-α基因在临床多种疾病中所发挥的分子机理奠定基础。     

家蚕质型多角体病毒荧光定量PCR检测方法的建立

根据GenBank报道的家蚕质型多角体蛋白基因的保守序列设计特异性引物扩增118bp核苷酸片段,使用含有目的基因片段的重组质粒标准品绘制标准曲线,建立家蚕质型多角体病毒的实时荧光定量PCR检测方法。结果表明,标准曲线中模板拷贝数(X)与Ct值(Y)关系为Y=-3.582lgX+38.748,相关系数R2=0.999,构建的实时荧光定量PCR检测方法具有良好的敏感性、特异性和重复性,可用于家蚕质型多角体病毒病的快速检验及该病的流行性调查研究。     

邻位连接技术：一种新的高灵敏度蛋白质检测技术

蛋白质组学(proteomics)诞生以来,高效准确的蛋白质检测技术受到越来越多的关注.最近 ,一种高灵敏度的蛋白质检测技术,邻位连接技术(proximity ligation assay, PLA)被建 立.该技术采用核酸适体(aptamer)或单/多克隆抗体 核酸复合物作为邻位连接探针(proximity probes).当一对邻位探针同时识别同一个目标蛋白分子时,它们将在空间位置上相互临近,通过连接反应形成一段可扩增的DNA标签序列,该标签序列能够反映待测蛋白的种类及浓度.该技术将对蛋白质的检测转变为对DNA核酸序列的检测,实现了特殊蛋白质的检测,定量及定位.文章从该方法的产生背景,发展过程,原理以及探针制备等方面对该方法进行了系统的介绍,列举了该方法的几种重要应用,并对该方法在蛋白质组学研究领域的应用前景进行了展望.     

小麦脱水素基因wzy2表达量实时荧光定量PCR方法的建立和应用

以陕合6号小麦品种为材料,用SYBR GreenⅡ染料,参照小麦脱水素wzy2和-βactin基因序列设计引物,建立小麦wzy2基因的实时荧光定量PCR分析方法.结果表明:通过对标准品标准曲线和熔解曲线分析,其标准曲线的Ct值检测范围为12~30,PCR扩增效率高达111.3%;不同的标准品扩增曲线的间距为3.078,接近于理想值3.32,且可显示产物特异的单峰,引物的特异性扩增强.小麦脱水素基因wzy2表达量实时荧光定量PCR的测定结果表明,小麦脱水素基因wzy2在胁迫24 h的表达量明显高于胁迫12 h的表达量.     

再论一类酶促反应化学动力系统

研究文[2]所讨论过的关于C.S.T.R反应器的一类两分子饱和反应模型x=-k1xy+q(x0+x),y=k1xy-kzy/1+ry-qy,并给出了一些具有指导实践意义的信息.     

改良法克隆淋球菌特征核酸片段

目的：采用改良法克隆淋球菌特征核酸片段300bp到pBS.sk中,作为淋球菌检测试剂盒的阳性标本来源。方法：采用PCR扩增淋球菌特征核酸片段300bp,扩增条件：94℃30s,55℃1min,72℃1min,35个循环,另外用SmalI酶切,pBS,sk,与PCR产物采用改良法平端连接：连接温度14℃,72h,连接反应体积15μl,加10u SamlⅠ防止pBS.sk自连,连接完成后取5μl连接液转化200μlCaCl2制备的感受态受体菌JM109,用碱法提取重组子质粒,电泳比较质粒大小,PCR初筛,最后双酶切鉴定。结果：经过电泳比较质粒大小,PCR初筛,最后双酶切鉴定。结果：经过电泳比较质粒大小,PCR初筛,最后双酶切鉴定,得到5个克隆重组子。     

猴免疫缺陷病毒（SIV）实时荧光定量PCR检测方法的建立

目的建立快速、敏感、特异的猴免疫缺陷病毒（SIV）TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法,对SIV病毒核酸进行定量检测。方法RT—PCR扩增SIVmac251保守gag基因序列796bp片段,进行TA克隆,构建标准品质粒pMD—SIVgag。通过对SIV定量外标准品的定量分析,优化反应体系,检测TaqMan探针实时荧光定量PCR方法的灵敏度、特异性和重复性。结果所建立的SIVQPCR检测方法,质粒DNA模板在10’～10。拷贝之间表现较好线性和相关性,标准曲线所得斜率为-3．26,相关系数为0．999。检测灵敏度达到200拷贝,方法重复性测试,检测25份临床样品CV％均小于1％。结论建立的SIVQPCR检测方法特异性、敏感性高,稳定性好,可用于定量测定猴免疫缺陷病毒（SIV）核酸拷贝量。     

甘蔗杆状病毒荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用

为建立一种能够快速、灵敏、特异的检测甘蔗杆状病毒(sugarcane bacilliform virus, SCBV)的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法,针对SCBV的基因序列,设计了特异性扩增引物,利用构建的标准品建立和优化针对SCBV的荧光定量PCR检测方法,并对该方法进行了特异性、稳定性、灵敏性等的测试,随后用于田间样品的检测。结果表明:将含有SCBV基因组序列的重组质粒进行梯度稀释制成标准品,利用标准品进行荧光定量PCR,获得标准曲线y=-3.482 1x+37.264,相关系数r~2=0.999 9,说明CT值与反应起始模板数量呈线性关系,可进行准确定量;组内和组间变异系数在0.19%～1.68%之间,表明检测方法重复性良好;建立的荧光定量PCR方法最低可检测到10个拷贝重组质粒/μL,是常规PCR检测灵敏度的100倍。使用建立的荧光定量PCR方法和常规PCR方法对采集的90份甘蔗叶片样品进行检测,常规PCR检出53份阳性样品,荧光定量PCR检出56份阳性样品,表明所建立的荧光定量PCR方法较常规PCR敏感性高,且准确性高。本研究建立的SCBV荧光定量PCR检测方法重复性好,灵敏度高,为构建甘蔗健康种苗体系提供了一种高效检测方法。     

珍稀濒危保护植物蒙古扁桃的生长特性研究

通过连续9 a定株观测方法,研究了蒙古扁桃物候期对应气候因子指标、年株高变化、地径生长、冠幅变化及根系变化规律,结果表明:物候期与气温、地表温度、地温(15 cm)、空气湿度和水汽压等因子关系密切,而与蒸腾量和日照时数关系较疏;年株高变化符合直线方程:y=18.91 8x-0.780 6(R2=0.991 5);年地径变化符合直线方程:y=0.275 6x 0.348 6(R2=0.999 2);年冠幅变化符合指数方程:y=50.371e0.2527x(R2=0.989 9);根系纵向和横向生长趋势分别符合指数函数方程:y=12.914e0.7358x(R2=0.971 5)和y=17.126e0.6918x(R2=0.965 4),但纵向生长落后于横向生长,即侧根生长优于主根。     

甲型H1N1流感病毒核酸荧光定量RT-PCR检测技术

目的:建立基于TaqMan荧光探针技术的甲型H1N1流感病毒实时定量RT-PCR方法。方法:分析H1N1流感病毒基因特性,根据新发甲型H1N1流感病毒突变基因片段设计检测引物和TaqMan荧光探针,建立荧光定量RT-PCR检测体系,体外转录制备RNA标准品,进行特异性、敏感性、重复性及盲样检测评价实验。结果:可特异性有效检测新发甲型H1N1流感病毒核酸,与H1～H16流感病毒基因无交叉反应;对RNA标准品的检测敏感性达103拷贝/μL;重复性实验中,阳性标准品Ct值变异系数(CV)10%,阴性标准品检测结果均呈阴性;12份盲样检测结果特异性好。结论:该荧光定量RT-PCR方法可作为甲型H1N1流感防控的病原快速诊断技术。     

一种检测慢病毒滴度的实时荧光定量PCR方法

目的:建立一种有效、灵敏、准确的慢病毒滴度的分子检测方法。方法:分别构建慢病毒调控元件WPRE和单拷贝基因白蛋白(Alb)基因的重组质粒,紫外吸收法测量后经数学换算得到相应的拷贝数,以梯度稀释质粒为模板,利用基于SYBR Green的荧光定量PCR制作标准曲线,最后将待测样品的Ct值代入标准曲线,根据相应公式计算慢病毒滴度。结果:WPRE元件和Alb基因质粒的标准曲线回归方程分别为y=-4.255x+46.047、y=-2.8735x+35.831,相关系数R2均大于0.99,扩增效率E均大于95%,且熔解曲线波峰单一。计算获得不同稀释比例待测病毒的滴度为(4.3±0.9)×106TU/mL。结论:基于SYBR Green的实时荧光定量PCR方法操作简便,能够准确测定慢病毒滴度。     

基于微滴式数字PCR技术的甲型流感病毒绝对定量方法的建立及应用北大核心CSCD

数字PCR(Digital PCR,dPCR)是核酸绝对定量的新方法,然而,基于dPCR的甲型流感病毒(Influenza A virus,FluA)绝对定量方法还未系统建立。本研究首先对微滴式dPCR的退火温度进行了梯度优化,确定了dPCR反应的最佳退火温度为64.4℃;利用FluA核酸标准品,确定了微滴式dPCR对FluA的检测范围为37.7~8.22"104拷贝/#L,检测的检出限为3.77拷贝/反应。微滴式dPCR的检测结果与标准品拷贝数的相关系数为R2=0.9988,提示该方法检测结果具有较高的可信度。用建立好的微滴式dPCR方法可对待测临床样本中的FluA进行了拷贝数定量。因此本研究建立了基于微滴式dPCR的FluA绝对定量方法,可有效地对临床样本中甲型流感病毒载量进行绝对定量,为临床研究中病毒载量的测定提供了一种技术。