基于同源基因的病原菌鉴定和分型靶位点的功能基因组学研究

利用病原菌序列差异,对病原菌特定基因和位点进行检测,可以快速发现和鉴别病原菌的分类和特征,对传染病快速诊断和溯源具有基础性意义和重要价值.本文旨在覆盖中国重要传染病的103种病原菌,寻找各分类阶元中特有的同源基因,并从中挑选出适合用于病原菌鉴定、分型的候选基因.利用生物信息学和基因组学方法,对已有全基因组序列的275株病原菌的836415个基因进行比对分析,进一步明确菌株的门、纲、目、科、属各分类阶元中特有的同源基因集合;通过COG功能分类方法,对同源基因集合进行功能注释,并分析在不同分类阶元内的保守基因功能的变化规律.本研究寻找到适合鉴定和分型的不同分类阶元（门、纲、目、科、属）的同源基因集合共19563个（门2891个、纲1016个、目3601个、科10130个、属1925个）.对同源基因功能的分析表明,适合对病原菌进行鉴定的基因在不同分类阶元中,表现的功能存在较大差异.革兰氏阳性和阴性病原菌在不同分类阶元中,同源基因表现出的功能也存在差异.该结果将为对在中国广泛存在的病原菌进行检测所涉及的探针、芯片设计提供理论依据,加快目标探针的筛选工作.同时,研究也是首次将世界范围内的全基因组数据和中国重大传染病涉及的病原菌紧密联系结合,为利用功能基因组学开展区域性、有针对性的病原检测和监测,提供候选基因和位点筛选的新方法.相关结果在细菌的元基因组学研究中也具有一定的应用价值.     

实时荧光定量TaqMan-MGB探针法检测杆菌样巴尔通体

【目的】应用Taq Man探针实时荧光定量PCR技术建立特异性强、敏感性高和稳定性好的快速杆菌样巴尔通体检测方法。【方法】应用生物信息学方法查找杆菌样巴尔通体特有基因,从中筛选出一段特有的基因序列为模板设计探针和引物。通过比较Ct值和荧光强度确定扩增反应的最佳退火温度、探针和引物浓度;将扩增产物连接到p EASY-T载体上制备标准品,绘制标准曲线,分析扩增效率和线性关系;评估方法的特异性、敏感性及重复性。【结果】优化后退火温度为60°C,探针和引物浓度均为200 nmol/L,反应体系20μL。特异性实验显示只有杆菌样巴尔通体扩增出荧光信号,其他种属细菌均未见荧光信号;标准曲线线性关系良好(R2=1),扩增效率E=98.18%;最低检出限为每个PCR反应3个拷贝;组内和组间的变异系数CV值分别为0.21%–0.42%和0.29%–0.59%,在允许范围内。【结论】研究建立的实时荧光定量Taq Man-MGB探针法特异性强、灵敏度高、稳定性好,可快速检测鉴定杆菌样巴尔通体,为这种巴尔通体所引起的一系列疾病的早期快速诊断、监测和流行病学调查等研究提供有效手段。     

利用系统进化树对H7N9大数据预测传播模型的评估

活禽贸易和H7N9禽流感病毒传播之间存在关联,应用大数据技术分析活禽交易网络数据,可进行疫情溯源并预测未来传播趋势。从流感研究数据库中获取了截止至2013年分离得到的H7N9毒株的血凝素基因核酸序列,构建系统进化树推断2013年上半年疫情中H7N9在各省及城市间的传播情况,并与大数据推断结果进行对比分析。结果表明,系统进化树推断结果更为准确,但大数据分析能够提供更多地区的信息且具有更好的时效性,同时推断的传播模型准确度较高,在H7N9疫情的应对中具有较高的应用价值。     

eEF1A1通过HGF/c-MET通路调控肝癌细胞的迁移和侵袭能力

目的 探讨真核翻译延长因子1A1(eukaryotic translation elongation factor 1 α 1,eEF1A1)对肝癌细胞的侵袭、迁移和HGF/c-MET通路的影响及作用机制。方法 采用qRT-PCR和Western bolt检测肝癌细胞和组织中eEF1A1表达。构建eEF1A1敲除载体转染HLF和Alex肝癌细胞,CCK-8和Transwell实验检测细胞的增殖、侵袭和迁移能力。KM plotter分析患者的总体预后。通过eEF1A1基因敲除的转录组测序,Western bolt检测HGF、c-MET和p-c-MET蛋白的表达。裸鼠皮下成瘤实验检测eEF1A1对肝癌肿瘤的影响。结果 eEF1A1在肝癌细胞和组织中显著升高,敲低eEF1A1能抑制HCC细胞的增殖、迁移和侵袭。eEF1A1高表达与肝癌的不良预后相关。此外,敲除eEF1A1显著降低HGF和p-c-MET蛋白水平,抑制肝癌肿瘤的生长,但c-MET蛋白水平无显著差异。结论 eEF1A1通过抑制HGF/c-MET信号通路抑制肝癌细胞迁移和侵袭。     

霍乱弧菌N16961超级整合子重复序列及基因盒分析

目的:确定O1群El Tor型霍乱弧菌N16961超级整合子(SI)中霍乱弧菌重复序列(VCR)的序列特点,以及VCR和基因盒的数量及位置。方法:用局部序列比对软件BLAST将VCR参考序列与霍乱弧菌N16961的Ⅱ号染色体进行比对,用Artemis Comparison Tool查看比对结果获得比对区域的位置信息,并采用perl语言脚本获得霍乱弧菌N16961的Ⅱ号染色体VCR相应区域的序列;用全局比对软件Clustal W将上一步获得的所有VCR序列进行多序列比对,采用perl语言脚本处理比对结果获得一致性序列;用MEGA4.0软件查看多序列比对结果,并采用perl语言脚本计算各位置变异频率,据此分析霍乱弧菌N16961的Ⅱ号染色体上VCR和基因盒的特点。结果:在N16961的超级整合子中有158个VCR,其核苷酸长度为117～124 bp;其一致性序列有126个核苷酸,其中37个为保守核苷酸位点,89个为可变核苷酸位点;139个VCR与相邻的VCR之间至少有1个基因,19个VCR相互之间没有任何基因;N16961的SI中共存在146个基因盒,基因盒大小为390～5924 bp不等,每个基因盒中整合的基因数目为1～9个不等。结论:建立了SI中VCR和基因盒的分析流程,分析了SI中VCR的保守及变异位点,明确了霍乱弧菌N16961的SI中VCR和基因盒的信息,为霍乱弧菌和其他细菌中SI的研究提供了分析基础。