TaqMan荧光定量RT-PCR检测水稻RAcl基因mRNA方法的建立

构建包含RAcl基因cDNA片段的质粒,作为水稻肌动蛋白基因RAcl之mRNA定量检测的标准品,建立检测方法,为水稻其他基因的定量建立内参。从水稻叶总RNA中逆转录扩增总cDNA,PCR扩增RAcl基因中设计的目的片段,将纯化的目的片段与pMD19-T Simple载体进行连接,转化宿主菌JM-109,提取重组质粒DNA,PCR鉴定并测序分析。纯化质粒并检测260nm吸光值,确定重组质粒原液的拷贝浓度并以此制备荧光定量PCR梯度浓度标准品,进行实时荧光定量PCR实验。建立了RAcl基因mRNA表达实时荧光定量PCR检测方法,特异性好,检测灵敏度达102拷贝,线性范围为102—1护拷贝,阈值循环数（Ct）与PCR体系中起始模板量的对数值之间有着良好的线性关系（r=1．000）,扩增效率高（E=98．2％）。建立了基因RAcl实时定量PCR的质粒标准品。     

版纳微型猪近交系TNF-α基因mRNA实时荧光定量PCR检测方法的建立

目的快速、灵敏、可靠的检测与临床多种疾病密切相关的重要基因TNF-α的表达情况,构建TNF-α基因及内参GAPDH基因荧光定量PCR质粒标准品。方法利用版纳微型猪近交系4～6月龄猪建立动物模型,提取皮肤创面总RNA,设计特异引物,进行RT-PCR扩增。纯化目的片段与pMD18-T载体连接,转化宿主菌DH5α,提取重组质粒DNA,并经酶切、PCR和测序鉴定,计算重组质粒原液拷贝数浓度并制备梯度浓度标准品,进行实时荧光定量PCR,生成标准曲线。结果建立的TNF-α基因和GAPDH内参基因mRNA表达实时荧光定量PCR检测方法灵敏度分别可达103和105拷贝,线性范围分别为103～109和105～109拷贝,阈值循环数(Ct)与PCR体系中起始模板量的对数值之间存在的线性关系R2分别为0.993和0.999,扩增效率E分别为111.073%和95.948%。结论成功的构建了版纳微型猪近交系TNF-α基因质粒标准品和标准曲线,并用内参基因GAPDH进行校正,此方法可为探讨TNF-α基因在临床多种疾病中所发挥的分子机理奠定基础。     

标准品制备方法对FQ-PCR定量基因表达水平的影响

实时荧光定量PCR (FQ-PCR)标准曲线法准确定量基因表达的关键在于标准品与待检样本的扩增效率是否一致. 为检测DNA标准品与样本cDNA扩增效率的一致性,探讨定量用标准品的最佳制备方法,本研究以脂肪酸结合蛋白5(Fabp5)、过氧化物酶体增殖活化受体α (Ppar-α)及β肌动蛋白（β-Actin）的3个基因为对象,分别采用质粒纯化法、PCR产物直接纯化法、PCR产物凝胶回收法制备DNA标准品,10倍梯度稀释后用FQ PCR制作标准曲线. 并以10倍梯度稀释的样本cDNA标准曲线的参数为对照,进行比较分析. 结果表明,不同方法制备的DNA标准品的扩增效率差异较大,并且与cDNA的扩增效率不一致,不能对cDNA样本进行准确定量. 另外,虽然目的基因在cDNA样本中的拷贝未知,不能对基因表达水平进行绝对定量,但因不同cDNA样本的同一基因的扩增效率一致, 可对基因的表达进行准确的相对定量.     

埃博拉病毒莱斯顿亚型实时荧光定量PCR检测方法的建立

本研究的目的为建立一种灵敏、快速、定量检测埃博拉病毒莱斯顿亚型核酸的实时荧光定量PCR检测方法及试剂盒。首先选择埃博拉病毒莱斯顿亚型的保守基因NP基因作为检测靶目标,筛选出保守序列并设计合成一对特异性引物。然后将连有NP全长基因的重组质粒作为定量标准品,将10倍系列稀释的重组质粒进行荧光定量PCR扩增,绘制标准曲线,并进行重复性、灵敏度及特异性检测。结果显示建立的埃博拉病毒莱斯顿亚型荧光定量PCR检测方法,其灵敏度可达102拷贝/μL,不同梯度标准品间线性关系(R2)达0.997,斜率为-0.3101,扩增效率为110.145%,所有标准品均在79.94℃出现尖且窄的特异性熔解峰。利用该检测系统可以快速定量检测埃博拉病毒莱斯顿亚型核酸,灵敏度高、重复性好,可用于基础及临床实验室对埃博拉病毒莱斯顿亚型感染的快速诊断和临床效果的监测,具有实际的应用价值。     

家蚕质型多角体病毒荧光定量PCR检测方法的建立

根据GenBank报道的家蚕质型多角体蛋白基因的保守序列设计特异性引物扩增118bp核苷酸片段,使用含有目的基因片段的重组质粒标准品绘制标准曲线,建立家蚕质型多角体病毒的实时荧光定量PCR检测方法。结果表明,标准曲线中模板拷贝数(X)与Ct值(Y)关系为Y=-3.582lgX+38.748,相关系数R2=0.999,构建的实时荧光定量PCR检测方法具有良好的敏感性、特异性和重复性,可用于家蚕质型多角体病毒病的快速检验及该病的流行性调查研究。     

枣疯病植原体实时荧光定量PCR检测方法的研究

目的:建立枣疯病植原体拷贝数检测实时荧光定量PCR方法,为枣疯病植原体定量检测提供技术支持。方法:构建质粒标准品,设计实时荧光PCR探针引物,优化体系,建立标准曲线,并进行重复性验证。结果:制备了枣疯病植原体标准质粒,建立了稳定的质粒标准品检测体系(R2=0.998,检测限10拷贝,定量限100拷贝)。结论:实时荧光定量PCR检测方法重复性好,可用于枣疯病植原体的拷贝数检测,为枣疯病植原体检验检测和病害防治提供了技术支持。     

拟除虫菊酯降解酶基因APs实时荧光定量PCR检测方法的建立

本研究建立了一种能够快速、灵敏地检测来源于铜绿假单胞菌GF31中拟除虫菊酯降解酶基因APs的SYBR GreenⅠ相对实时荧光定量PCR方法。通过克隆构建APs目的基因及16S rRNA内参基因重组质粒,分别制备了质粒标准品SgI-pET30a、PA-pET30a、Pep-pET30a以及16S r RNA-p ET30a;绘制标准曲线,建立了实时荧光定量PCR体系。结果显示,在质粒标准品浓度为0.001~10 ng范围内,实时定量PCR标准曲线的线性关系良好,APs和16S r RNA的标准曲线R~20.99,扩增效率=95%~105%;熔解曲线呈单峰,特异性良好;扩增曲线呈S型,CT值在各梯度间均匀变化、重复性好;将建立的相对实时荧光定量PCR方法应用于检测工程菌及野生菌APs基因的m RNA表达水平,2~(-△△Ct)法计算得工程菌SgI、PA及Pep的表达量分别为野生菌的1 898、1 314和956倍。     

双重荧光定量PCR检测志贺毒素stx1和stx2基因

目的建立一种双重荧光定量PCR检测志贺毒素stx1和stx2基因的方法。方法根据不同细菌来源的stx1和stx2序列,设计PCR引物和TaqMan探针,建立双重实时荧光定量PCR检测体系,进行灵敏度、特异性和重复性评价,并对腹泻患者粪便样本进行检测分析。结果双重实时荧光定量PCR检测含志贺毒素基因重组质粒的最低检测下限为102 copies/mL;该法对12种常见肠道病原菌均无特异性扩增,对不同浓度的标准质粒检测重复性高,Ct值变异系数均小于10%;对急性腹泻粪便标本的检测阳性率高于细菌分离培养。结论建立的双重实时荧光定量PCR可作为不同细菌来源的志贺毒素基因的快速鉴定方法,亦可用于人感染性腹泻标本的快速筛查。     

美国白蛾核型多角体病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

为了建立对昆虫核型多角体病毒（nucleopolyhedrovirus）进行定量检测方法,本研究选用美国白蛾Hyphantria cunea核型多角体病毒的polyhedrin基因为目的基因,经引物设计、PCR 扩增、目的片段与载体连接转化以及重组质粒的鉴定,并对重组质粒标准品和样品DNA进行检测,构建出美国白蛾核型多角体病毒SYBR GreenⅠ荧光定量标准曲线。统计学分析显示标准品浓度的对数值与Ct 值之间存在良好的线性关系（R=0.998）。该方法的检测灵敏度为10¹～10²拷贝/μL,线性范围达5个数量级,扩增产物形成单一的特异性熔解峰,组内组间的变异系数均小于3%。根据已建立的方法对不同感染时间段的感病幼虫进行检测,每毫克幼虫样本内病毒polyhedrin基因拷贝数增殖倍数对数值与感染时间（d）呈正相关（R=0.987）。这些结果表明,建立的美国白蛾核型多角体病毒荧光定量 PCR检测方法是可靠的,具有灵敏度高、重复性好等特点,可为昆虫核型多角体病毒体内增殖动态研究及昆虫病毒的标准化生产提供参考。     

猴免疫缺陷病毒（SIV）实时荧光定量PCR检测方法的建立

目的建立快速、敏感、特异的猴免疫缺陷病毒（SIV）TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法,对SIV病毒核酸进行定量检测。方法RT—PCR扩增SIVmac251保守gag基因序列796bp片段,进行TA克隆,构建标准品质粒pMD—SIVgag。通过对SIV定量外标准品的定量分析,优化反应体系,检测TaqMan探针实时荧光定量PCR方法的灵敏度、特异性和重复性。结果所建立的SIVQPCR检测方法,质粒DNA模板在10’～10。拷贝之间表现较好线性和相关性,标准曲线所得斜率为-3．26,相关系数为0．999。检测灵敏度达到200拷贝,方法重复性测试,检测25份临床样品CV％均小于1％。结论建立的SIVQPCR检测方法特异性、敏感性高,稳定性好,可用于定量测定猴免疫缺陷病毒（SIV）核酸拷贝量。     

Determination of stoichiometry of radioiodination of proteins

A sensitive method for the detection of small quantities of hydrophobic antioxidant free radical scavengers such as butylatedhydroxytoluene (BHT) and butylatedhydroxyanisole (BHA) in aqueous samples is described. The procedure involves extraction of the hydrophobic free radical scavenger into an organic solvent phase, followed by the subsequent reaction of an aliquot of this extract with the stable cation radical tris(p-bromophenyl)amminium hexachloroantimonate (TBACA). In experiments with BHT and BHA, the loss of TBACA absorbance at 730 nm was found to be linearly proportional to the amount of antioxidant added, with quantities of BHT as small as 200 pmol being easily detectable. In aqueous suspensions of dimyristoylphosphatidylcholine vesicles, assays of the aqueous BHT concentration showed that BHT partitioned strongly into the membrane phase, achieving very high BHT/phospholipid ratios. For a given concentration of BHT, partitioning into the membrane phase was greater in large, multilamellar liposomes than in either small, single-walled vesicles or in purified rat brain synaptic vesicle membranes. Direct assay of BHT and BHA in phospholipid membranes, however, was complicated by a nonspecific interaction between TBACA and the phospholipid.