版纳微型猪近交系TNF-α基因mRNA实时荧光定量PCR检测方法的建立 |
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引用本文: | 霍金龙,李颖,赵跃,潘伟荣,刘丽仙,霍海龙,曾养志.版纳微型猪近交系TNF-α基因mRNA实时荧光定量PCR检测方法的建立[J].中国实验动物学报,2011,19(2):153-160. |
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作者姓名: | 霍金龙 李颖 赵跃 潘伟荣 刘丽仙 霍海龙 曾养志 |
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作者单位: | 1. 云南农业大学,云南省版纳微型猪近交系重点实验室,昆明,650201 2. 昆明医学院,第二附属医院整形外科,昆明,650101 3. 云南农业职业技术学院,畜牧兽医系,昆明,650212 |
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基金项目: | 云南省应用基础研究计划面上项目,云南省教育厅科学研究基金 |
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摘 要: | 目的快速、灵敏、可靠的检测与临床多种疾病密切相关的重要基因TNF-α的表达情况,构建TNF-α基因及内参GAPDH基因荧光定量PCR质粒标准品。方法利用版纳微型猪近交系4~6月龄猪建立动物模型,提取皮肤创面总RNA,设计特异引物,进行RT-PCR扩增。纯化目的片段与pMD18-T载体连接,转化宿主菌DH5α,提取重组质粒DNA,并经酶切、PCR和测序鉴定,计算重组质粒原液拷贝数浓度并制备梯度浓度标准品,进行实时荧光定量PCR,生成标准曲线。结果建立的TNF-α基因和GAPDH内参基因mRNA表达实时荧光定量PCR检测方法灵敏度分别可达103和105拷贝,线性范围分别为103~109和105~109拷贝,阈值循环数(Ct)与PCR体系中起始模板量的对数值之间存在的线性关系R2分别为0.993和0.999,扩增效率E分别为111.073%和95.948%。结论成功的构建了版纳微型猪近交系TNF-α基因质粒标准品和标准曲线,并用内参基因GAPDH进行校正,此方法可为探讨TNF-α基因在临床多种疾病中所发挥的分子机理奠定基础。
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关 键 词: | 版纳微型猪近交系 实时荧光定量 TNF-α基因 GAPDH基因 基因表达 |
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