人4型腺病毒拷贝数SYBR Green Ⅰ实时定量PCR检测方法的建立

目的:建立检测人4型腺病毒拷贝数的荧光定量PCR方法。方法:提取本实验室构建的4型腺病毒全基因组质粒,以梯度稀释质粒为标准模板,选取人4型腺病毒六邻体区域基因设计一对特异性引物,进行SYBR GreenⅠ荧光定量PCR扩增并制作标准曲线。结果:标准曲线为y=-4.284x+53.468,由全基因组质粒所构建的标准曲线线性关系良好,扩增反应Ct值与拷贝数的对数呈线性关系(R2=0.999 609),检出敏感度可达1×102拷贝/μL,且与其他几种腺病毒无交叉反应。用该方法检测4型腺病毒感染细胞2、12和24 h后的病毒拷贝数,其病毒拷贝数随时间增加,与细胞病变(CPE)变化保持一致,且荧光定量PCR的测量结果稳定(变异系数6%)。结论:建立了检测人4型腺病毒基因拷贝数的荧光定量RT-PCR方法,该方法灵敏度高、特异性强。     

REAL-TIME PCR方法测定转基因小麦中外源基因拷贝数

采用SYBR GreenⅠ real-time PCR方法检测7株转基因小麦中外源半夏凝集素基因的拷贝数。以小麦蜡质基因（wx012）作为内参基因,以未转基因小麦基因组DNA为内参基因标准品进行5倍梯度稀释得到内参基因CT值与起始模板量的相关性标准曲线：y=-0.2667x+6.98;以含半夏凝集素基因（pta）的质粒DNA为目的基的因标准品同样进行5倍梯度稀释,建立目的基因CT值与起始模板量的相关性标准曲线：y=-0.2118x+4.53。通过SYBR GreenⅠ real-time PCR分别获得每一样本中目的基因和内参基因的CT值,将CT值分别代入标准曲线计算该样本中内参基因和目的基因起始模板量,目的基因与内参基因起始模板量比值即是目的基因在该转基因植株中的拷贝数。计算结果为：单拷贝的有1株,2个拷贝1株,3拷贝和4拷贝的各有2株,其中有1株为假阳性植株。     

SYBR Green I实时荧光定量RT-PCR测定猴免疫缺陷病毒RNA拷贝数方法的建立

目的建立SYBR Green I荧光染料实时定量RT-PCR方法,测定猴免疫缺陷病毒(SIV)RNA拷贝数。方法巢式RT-PCR扩增SIV病毒RNAgag基因上1360-1837之间的长度为477 bp的片段,将该片段克隆到pGEMT载体上,构建pGEM-SIVgag477质粒。该质粒经限制性内切酶NotⅠ酶切后,进行体外转录,转录出的RNA产物(RS)纯化后10倍系列稀释,作出标准曲线,作为SIV病毒RNA荧光定量检测的外标准品。结果应用Qiagen公司QuantiTect SYBR GREEN RT-PCR Kit,该标准品可精确定量到100 copies/μL。结论制备的RS外标准品纯度高,SYBR Green I荧光染料实时定量RT-PCR法特异性、敏感性高,稳定性好,可用于定量测定猴免疫缺陷病毒(SIV)RNA拷贝数。     

SYBR Green Ⅰ实时荧光定量RT-PCR测定猴免疫缺陷病毒RNA拷贝数方法的建立

目的 建立SYBR Green Ⅰ荧光染料实时定量RT-PCR方法,测定猴免疫缺陷病毒(SIV)RNA拷贝数.方法 巢式RT-PCR扩增SIV病毒RNA gag基因上1360-1837之间的长度为477 bp的片段,将该片段克隆到pGEM T载体上,构建pGEM-SIVgag477质粒.该质粒经限制性内切酶Not I酶切后,进行体外转录,转录出的RNA产物(RS)纯化后10倍系列稀释,作出标准曲线,作为SIV病毒RNA荧光定量检测的外标准品.结果 应用Qiagen公司QuantiTect SYBR GREEN RT-PCR Kit,该标准品可精确定量到100 copies/μL.结论 制备的RS外标准品纯度高,SYBR Green Ⅰ荧光染料实时定量RT-PCR法特异性、敏感性高,稳定性好,可用于定量测定猴免疫缺陷病毒(SIV)RNA拷贝数.     

SYBR GreenⅠ实时荧光定量RT-PCR测定肠道病毒71型（EV71）RNA拷贝数方法的建立

目的建立SYBR GreenⅠ荧光染料实时定量RT-PCR方法,测定实验动物等来源的EV71病毒RNA。方法运用EV71VP1保守区引物,优化real time RT-PCR条件,运用NASBA方法扩增EV71病毒RNA,计算拷贝数,经10倍系列稀释做出标准曲线,作为EV71病毒RNA定量检测的外标准品。结果应用Qiagen公司QuantiTect SYBR Green RT-PCR Kit,该标准品可精确定量到100copies/μL,PCR扩增效率达到99.5%。结论 SYBRGreenⅠ荧光染料实时定量PCR法测定EV71病毒RNA拷贝数的方法敏感性高、稳定性好,可用于EV71病毒RNA载量的定量测定。     

茶树α-tubulin基因实时荧光定量RT-PCR方法的建立

目的:建立茶树α-tubulin基因实时荧光定量RT-PCR方法。方法:根据GenBank中茶树α-tubulin基因保守区域设计一对特异性引物,将PCR扩增得到的α-tubulin基因克隆到pTG19-T载体上,构建的重组质粒标准品经1/10梯度稀释后,用SYBR GreenⅠ染料法绘制标准曲线,并进行融解曲线分析。结果:标准曲线Ct值检测范围为14.56~27.09,相关系数为0.991,溶解曲线分析显示产物为特异的单峰,其Tm值为81±0.3℃。结论:建立了茶树α-tu bulin基因实时荧光定量RT-PCR法,为以α-tubulin作为茶树内参基因进行功能基因表达差异研究奠定了基础。     

水貂肠炎病毒SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法的建立

根据Gen Bank登录的水貂肠炎病毒(MEV)VP2蛋白基因的保守序列设计了1对特异性引物,经PCR扩增出146bp的目的片段,并克隆到pMD 18-T载体上,提取重组质粒经PCR及测序鉴定正确后,以10倍梯度稀释质粒作为阳性标准品,绘制荧光定量标准曲线,以此建立一种基于SYBR Green荧光染料的定量PCR特异性检测水貂肠炎病毒的方法。结果表明:该方法对MEV有很好的特异性,检测灵敏度为34拷贝/μL,且重复性试验变异系数均小于2%。临床检测中,在80份样品中检测到30份阳性样品,高于普通PCR和电镜观察方法的检出率。该方法的建立实现了对MEV临床早期快速诊断和定量分析,为毛皮动物MEV的防控提供了可靠的检测方法。     

甘蔗杆状病毒荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用

为建立一种能够快速、灵敏、特异的检测甘蔗杆状病毒(sugarcane bacilliform virus, SCBV)的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法,针对SCBV的基因序列,设计了特异性扩增引物,利用构建的标准品建立和优化针对SCBV的荧光定量PCR检测方法,并对该方法进行了特异性、稳定性、灵敏性等的测试,随后用于田间样品的检测。结果表明:将含有SCBV基因组序列的重组质粒进行梯度稀释制成标准品,利用标准品进行荧光定量PCR,获得标准曲线y=-3.482 1x+37.264,相关系数r~2=0.999 9,说明CT值与反应起始模板数量呈线性关系,可进行准确定量;组内和组间变异系数在0.19%～1.68%之间,表明检测方法重复性良好;建立的荧光定量PCR方法最低可检测到10个拷贝重组质粒/μL,是常规PCR检测灵敏度的100倍。使用建立的荧光定量PCR方法和常规PCR方法对采集的90份甘蔗叶片样品进行检测,常规PCR检出53份阳性样品,荧光定量PCR检出56份阳性样品,表明所建立的荧光定量PCR方法较常规PCR敏感性高,且准确性高。本研究建立的SCBV荧光定量PCR检测方法重复性好,灵敏度高,为构建甘蔗健康种苗体系提供了一种高效检测方法。     

杀鲑气单胞菌SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法的建立与应用

根据GenBank中杀鲑气单胞菌铁载受体(ferric siderophore receptor,fst A)基因序列设计并合成一对特异性引物,经过反应体系优化后建立了检测杀鲑气单胞菌的SYBR Green I实时荧光定量PCR检测方法。将fst A基因克隆到p MD18T载体上构建重组质粒pMD18T-fst A并制备标准曲线,结果显示该标准曲线的线性关系良好,扩增所得标准曲线为y=-4.255 2x+39.644,相关系数R2为0.988;熔解曲线分析显示产物为单一的特异峰。特异性检测结果表明,该方法对杀鲑气单胞菌及其亚种具有良好的特异性,与其他细菌不发生交叉反应;最低检测限为35拷贝/μL,较常规PCR的灵敏度高出约100倍。应用建立的方法对人工感染的虹鳟病样进行了检测,待检样品均呈阳性反应,表明该方法具有很好的适用性。研究表明,所建立的实时荧光定量PCR方法具有特异、灵敏、快速、定量的优点,可用于杀鲑气单胞菌的快速诊断及定量检测。     

拟除虫菊酯降解酶基因APs实时荧光定量PCR检测方法的建立

本研究建立了一种能够快速、灵敏地检测来源于铜绿假单胞菌GF31中拟除虫菊酯降解酶基因APs的SYBR GreenⅠ相对实时荧光定量PCR方法。通过克隆构建APs目的基因及16S rRNA内参基因重组质粒,分别制备了质粒标准品SgI-pET30a、PA-pET30a、Pep-pET30a以及16S r RNA-p ET30a;绘制标准曲线,建立了实时荧光定量PCR体系。结果显示,在质粒标准品浓度为0.001~10 ng范围内,实时定量PCR标准曲线的线性关系良好,APs和16S r RNA的标准曲线R~20.99,扩增效率=95%~105%;熔解曲线呈单峰,特异性良好;扩增曲线呈S型,CT值在各梯度间均匀变化、重复性好;将建立的相对实时荧光定量PCR方法应用于检测工程菌及野生菌APs基因的m RNA表达水平,2~(-△△Ct)法计算得工程菌SgI、PA及Pep的表达量分别为野生菌的1 898、1 314和956倍。     

表达增强型绿色荧光蛋白标记的hBax 和hHGF 双基因的慢病毒 载体构建

目的:构建绿色荧光蛋白标记的hBax和hHGF双基因共表达的重组慢病毒并鉴定。方法:通过重叠PCR技术构建attB1-K-hBAX/T2A/eGFP/P2A/hHGF-attB2基因片段,利用gateway technology构建慢病毒载体质粒pLV.EX2d.null-EF1A>hBAX/T2A/eGFP/P2A/hHGF和阴性对照质粒pLV.EX2d.null-EF1A>eGFP并测序,上述两种质粒分别与辅助质粒共转染293FT细胞包装病毒,荧光显微镜检测病毒滴度。结果:经鉴定慢病毒载体质粒构建正确,荧光显微镜检测hBax和hHGF共表达慢病毒滴度为7.8×107TU/mL,仅表达绿色荧光蛋白的阴性病毒滴度为9×107TU/mL。结论:表达增强型绿色荧光蛋白标记的hBax和hHGF双基因的慢病毒构建成功并获得高滴度的病毒感染液。     

慢病毒介导的RNAi对大鼠SOCS3基因表达的抑制作用

目的研究慢病毒表达载体介导的RNA于扰（RNAi）对大鼠下丘脑细胞中细胞因子信号转导抑制因子3（SOCSB）的抑制作用。方法根据大鼠SOCS3基因（NM053565）,用Ambion在线软件选择3个靶序列,设计并合成包含各正反义靶序列的互补单链寡核苷酸,与经BamHI和XhoI酶切后的慢病毒载体质粒pRNA-1enti-GFP连接产生pRNA-Lenti-SOCS3-GFP慢病毒重组质粒,与慢病毒包装混合物共转染293T细胞,包装产生慢病毒,收集病毒上清,采取逐孔稀释滴度法测定病毒滴度,然后转染大鼠下丘脑细胞,通过荧光显微镜观察细胞转染情况,利用荧光实时定量PCR方法检测RNAi组（siRNAl,siRNA2,siRNA3）、空白细胞组和阴性序列组（siRNA—Negtive）中SOCS3的表达情况。结果将目的序列成功连接到载体上,并经测序分析证实载体构建成功。系列稀释法检测慢病毒悬液的滴度为1．0×10^10TU／L。荧光实时定量PCR检测显示慢病毒感染大鼠下丘脑细胞后,与空白细胞组相比,3个RNAi组都有不同程度的抑制SOCS3表达,其中siRNAI组的抑制效果最好,可使SOCS3mRNA表达下调达80％。结论构建的pRNA-Lemi-SOCS3-GFP慢病毒载体可有效地抑制大鼠SOCS3的表达,为以SOCS3基因为靶点的相关疾病的基因治疗研究奠定基础。     

利用荧光定量PCR分析c-Ha-ras基因在C57-ras转基因小鼠中的拷贝数

目的:利用real-time PCR建立检测C57-ras转基因小鼠中外源c-Ha-ras基因拷贝数的简便方法,为药物安全性评价C57-ras转基因小鼠模型的繁殖和筛选提供数据支持。方法:以自建的人原癌基因c-Ha-ras转基因小鼠为研究对象,利用SYBR GreenⅠ荧光定量PCR的绝对定量法测定3个C57-ras转基因小鼠系的c-Ha-ras基因Ct值,通过与内参基因GAPDH比较计算获得转基因的拷贝数。结果:内参基因GAPDH的标准曲线为lg NGAPDH=-2.852Ct+26.236,外源基因c-Ha-ras的标准曲线为lg NRAS=-3.068Ct+39.186;经计算,NO.2、NO.3、NO.5系的F6代拷贝数分别为4、4和3,并且系内不同个体间拷贝数一致。结论:利用SYBR GreenⅠreal-time PCR技术建立了检测C57-ras转基因小鼠中外源基因拷贝数的方法,该方法操作简单,节约成本,为C57-ras致癌性模型的选留和应用提供了基础和技术手段,也为其他类似转基因品系中转基因拷贝数的确定提供了一种参考方法。     

一种实时荧光定量PCR检测Ⅱ型单纯疱疹病毒检测方法的研究

建立SYBR Green实时荧光定量PCR方法,用于快速、准确检测Ⅱ型单纯疱疹病毒(HSV-2)。设计特异性引物,PCR扩增糖蛋白G(g G)片段,构建p EASY-T1-g G2重组质粒作为标准品,绘制标准曲线,同时考察该方法的稳定性、灵敏性和特异性,并利用此方法检测HSV-2血清学确诊的生殖器疱疹临床样本。本实验获得的标准曲线R~2=0.997,相关性良好,灵敏度是普通PCR的1 000倍。用本方法检测HSV-2血清学确诊的生殖器疱疹临床样本均为阳性,符合率为100%,且每份样品检测结果的变异系数均小于2%。本研究建立的SYBR Green实时荧光定量PCR方法可用于临床HSV-2感染的检测。     

重组表达小鼠MIP-1α和B7-1基因的慢病毒载体的构建及鉴定

目的构建重组表达小鼠MIP-1α和B7-1基因的慢病毒载体,为淋巴瘤基因治疗的实验研究奠定基础。方法设计引物扩增获得目的基因小鼠MIP-1α和B7-1基因的全长编码序列cDNA,将目的基因与经酶切线性化的慢病毒载体进行定向连接,其产物转化感受态细胞,对长出的阳性克隆进行PCR鉴定和直接测序序列分析。MIP-1α和B7-1目的基因质粒转染293T细胞,观察绿色荧光蛋白（GFP）表达,采用Western Blot法检测其蛋白表达,实时荧光定量PCR,检测慢病毒浓缩液的滴度。结果成功构建了重组表达小鼠MIP-1α和B7-1基因的慢病毒载体,实时荧光定量PCR证实MIP-1α、B7-1基因重组慢病毒载体的滴度均达2.00E＋8 TU/mL。结论本研究成功构建并包装出高滴度的小鼠MIP-1α和B7-1基因重组慢病毒载体,为淋巴瘤基因治疗的实验研究奠定了基础。     

SYBR Green实时荧光PCR高通量检测转基因大豆油

采用SYBR Green实时荧光PCR技术,建立了食用大豆油转基因成分的检测方法.根据转基因大豆中内源参照基因lectin和外源基因35S启动子、NoS终止子和ep4 epsps基因,设计特异性引物,在Roche荧光PCR仪上进行实时荧光PCR扩增.荧光曲线表明,SYBR Green实时荧光PCR可特异性地检测大豆油中的转基因成分,方法准确、快速,并运用熔解曲线进行产物分析,验证了试验结果的特异性和准确性,检测方法灵敏度高.     

粪便中肠球菌SYBR GreenI荧光定量PCR检测方法的建立

目的利用SYBR GreenI荧光定量PCR方法,建立肠球菌实时荧光PCR检测方法,并初步应用于粪便中肠球菌的检测。方法根据GenBank发表的肠球菌23S rRNA基因序列的保守区域设计合成特异性的引物;利用构建的质粒标准品绘制两种标准曲线,构建基因拷贝数、细菌数为分析指标的定量分析模型并初步应用于粪便标本的检测分析。结果所建立的SYBR GreenI荧光定量PCR方法检测灵敏度可达7个拷贝数/reaction。粪便样本根据实时荧光定量PCR方法所得的理论数值与培养菌值之间差异无显著性(P>0.05)。非炎性腹泻标本中菌数与健康成人标本中菌数差异无显著性(P>0.05)。灵敏度曲线所得的数值大于菌数标准曲线,可能由于DNA提取过程中存在部分的损失。检测粪便标本结果显示SYBR GreenI荧光定量PCR方法较平板计数法敏感、快捷、简便。结论本研究建立了一种灵敏、特异、简便易行的肠球菌定量检测方法。     

早晚牙菌斑变异链球菌定植差异的定量PCR检测

目的 采用实时荧光定量PCR检测白天和晚上所形成牙菌斑生物膜中变异链球菌的数量,比较早晚牙菌斑中变异链球菌定植的差异.方法 收集30名健康成人全口口腔洁治后白天和晚上形成的龈上菌斑,提取细菌基因组DNA.合成变异链球菌特异性引物,纯化PCR产物获得目的基因连接于pTA-TA载体,克隆于大肠埃希菌DH5 α感受态细胞.选取阳性克隆测序后纯化质粒DNA,获得质粒标准品.将样本和梯度稀释的质粒标准品进行SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测,确定标准曲线,定量样本中变异链球菌DNA的拷贝数.结果 早晚牙菌斑细菌基因组DNA样本的扩增曲线均在标准品的扩增曲线范围内.晚上所形成牙菌斑中定植的变异链球菌数量(对数值7.67 ±0.77)高于白天定植的变异链球菌数量(对数值7.25±0.62)(P =0.007).结论 牙菌斑的微生物定植存在日夜节奏变化,晚上所形成牙菌斑中变异链球菌数量多于白天.     

短发夹RNA慢病毒载体稳定抑制NLRP3表达的HepG2细胞的构建

目的:构建针对NLRP3基因的短发夹RNA(sh RNA)慢病毒表达载体,在Hep G2细胞中鉴定该载体对NLRP3的抑制效果。方法:设计针对NLRP3基因的sh RNA序列,将其插入慢病毒表达载体p WPT-U6-sh RNA-CMV-GFP中,将载体与包装质粒ps PAX2、p MD2.G共转染293T细胞,进行病毒包装;得到的病毒原液浓缩后系列稀释为9个浓度递减的病毒液,分别转染293T细胞后进行滴度测定;用获得的慢病毒液感染人肝癌细胞系Hep G2,获得稳定沉默NLRP3的细胞株;利用实时定量PCR和Western印迹检测稳定细胞株中NLRP3的沉默效应。结果:构建了具有沉默效应的慢病毒干扰载体;稀释法测定干扰病毒滴度为2×108TU/m L;实时定量PCR和Western印迹实验均证实慢病毒转染后,细胞株中NLRP3表达水平明显降低。结论:构建了人NLRP3基因特异性慢病毒干扰载体,获得NLRP3基因稳定干扰的Hep G2细胞株。     

小麦脱水素基因wzy2表达量实时荧光定量PCR方法的建立和应用

以陕合6号小麦品种为材料,用SYBR GreenⅡ染料,参照小麦脱水素wzy2和-βactin基因序列设计引物,建立小麦wzy2基因的实时荧光定量PCR分析方法.结果表明:通过对标准品标准曲线和熔解曲线分析,其标准曲线的Ct值检测范围为12~30,PCR扩增效率高达111.3%;不同的标准品扩增曲线的间距为3.078,接近于理想值3.32,且可显示产物特异的单峰,引物的特异性扩增强.小麦脱水素基因wzy2表达量实时荧光定量PCR的测定结果表明,小麦脱水素基因wzy2在胁迫24 h的表达量明显高于胁迫12 h的表达量.