小鼠睾丸特异表达基因TSEG-1的克隆及序列分析

从表达序列标签(expressed sequence tags, ESTs)数据库ZooDDD中获得小鼠正常睾丸表达的EST, 通过dbEST数据库检索出与其高度同源的EST序列, 构建EST叠加群(contigs), Biolign软件拼接, GeneScan软件预测contigs对应的基因组序列中的外显子、内含子; 针对开放阅读框设计引物序列, 采用RT-PCR从小鼠睾丸组织中克隆新基因的cDNA, 分析该基因在小鼠各脏器中的mRNA表达, 并对测序结果进行生物信息学分析。结果表明: 在小鼠X染色体的1 668~2 011 kb间克隆出一新基因TSEG-1, 全长为510 bp, 开放阅读框为336 bp, 编码111氨基酸, 分子量12.84258 kDa, 等电点11.4000。RT-PCR证实该基因开放阅读框正确, 在小鼠睾丸组织中特异性表达, 且与小鼠其他cDNA 无同源性, 获得GenBank 登录号EU079024。功能区分析发现TSEG-1蛋白可能为一种跨膜蛋白, 跨膜区位于第41~61氨基酸残基。TSEG-1基因与人类睾丸特异性组蛋白2a变异体基因有较高同源性, 在TSEG-1基因5′-端非编码侧翼预测发现存在1个启动子区域, 范围为680 bp。 TSEG-1蛋白可能有4个抗原性位点, 2个特异性蛋白激酶的磷酸化位点, 其亚细胞定位可能位于线粒体。小鼠睾丸特异性基因TSEG-1的克隆为进一步研究其生物学功能和表达调控奠定了基础。     

一个新的睾丸特异表达基因的克隆及功能的初步分析

运用“数据库消减杂交”(digital differential display)方法来筛选人类睾丸特异表达新基因,获得了有差异显示的代表新基因的克隆重叠群。挑选其中一个克隆重叠群HS．326528进行多组织RT—PCR,初步获得该重叠群在人睾丸中有高表达。从该重叠群的IMAGE出发,采用生物信息学的方法快速克隆了一个人类新基因的全长cDNA序列,其全长1044bp,开放阅读框为214～529bp,定位于15q26．2,编码由105个氨基酸组成、分子量为11．7kD、等电点为10．09的一个碱性蛋白,该蛋白与已知蛋白无明显的同源性,克隆实验证明该基因的阅读框完全正确,RT—PCR和Northern blot显示该基因在人类睾丸中特异表达,实时PCR结果表明：该基因在成人睾丸中高表达,在精子中有中度表达,在胚胎睾丸中低表达,推测该基因与精子的生成有关,命名为SRG8(homo sapiens spermatogenesis—related gene 8)(GenBank登录号：AY489187),该基因编码的蛋白定位于细胞核。流式结果分析表明,SRG8基因能够促使HeLa细胞由S期向G2期的转变,从而加速细胞的分裂。这些结果表明SRG8基因可能在睾丸的发育及精子的形成过程中起重要的作用。     

牛RHOQ基因的电子克隆与生物信息学分析

利用电子克隆技术获得牛RHOQ基因cDNA序列,采用生物信息学方法对该基因及其编码蛋白的基本理化性质、疏水性、信号肽、二级结构和亚细胞定位等方面进行预测和分析。结果表明,牛RHOQ基因的cDNA序列全长1 517 bp,包含1个618 bp开放阅读框,编码205个氨基酸;其编码蛋白属疏水性蛋白,不存在信号肽及跨膜结构,定位于分泌系统囊泡;二级结构主要以无规则卷曲和α-螺旋为主。牛RHOQ基因编码蛋白可能具有生长因子功能,可能在神经再生和突触延伸过程中起重要作用。     

绵羊CAST基因2型和4型转录本的克隆及特性分析

钙蛋白酶抑制蛋白(Calpastatin, CAST)是一种内源性的需要Ca²⁺激活的钙蛋白酶抑制剂, 在肌肉组织的蛋白质降解过程中起重要的调节作用。文章利用牛^CAST基因的mRNA序列, 通过逆转录RT-PCR首次克隆获得绵羊CAST基因2型转录本和4型转录本的部分cDNA序列, 并对序列进行生物信息学分析。CAST基因2型转录本的扩增片段为4 385 bp, 完整的开放阅读框为2 361 bp, 编码786个氨基酸; CAST基因4型转录本的扩增片段为1 467 bp, 完整的开放阅读框为1 317 bp, 编码438个氨基酸。CASTⅡ型蛋白序列存在4个保守结构域, CASTⅣ型蛋白序列存在3个保守结构域; 两者的二级结构均以螺旋为主, 富含疏水区域, 其氨基酸序列存在多个磷酸化位点以及蛋白激酶C(Protein kinase C, PKC)的磷酸化位点。通过RT-PCR分析CAST基因2型转录本和4型转录本的组织表达谱, 结果表明CAST基因2型转录本在所检测的10个组织中均表达, CAST基因4型转录本仅在睾丸组织中表达。     

野生茄子（Solanum torvum）抗黄萎病相关基因Sto Vel的克隆与分析

采用RT—PCR和RAcE技术从野生茄子中扩增克隆到一个抗黄萎病相关基因,命名为StoVel,其cDNA全长3400bp,含有3153bp的完整开放阅读框,编码1051个氨基酸,该基因编码的蛋白序列与刚果野茄、类番茄和番茄Vel编码的氨基酸序列同源性分别为82％、81％和80％,且有很高的功能区段保守性。将该cDNA全长序列提交Gen Bank,登陆号为DQ020574。半定量PCR表明该基因为组成型表达,在根中表达最多,叶中最少。     

毛尖紫萼藓抗旱相关基因Gp-LEA的克隆与表达分析

以毛尖紫萼藓干旱cDNA文库中获得的一段与LEA基因同源性较高的EST序列为基础,采用RACE技术分离该基因cDNA全长序列,命名为Gp-LEA。Gp-LEA基因的cDNA全长814bp,开放阅读框456bp,编码含151个氨基酸蛋白质。生物信息学分析结果显示,Gp-LEA蛋白为稳定蛋白,分子质量为16.612kD,理论等电点（pI）为5.06,含有LEA₂功能结构域,不属于跨膜蛋白且不存在信号肽。系统发生分析表明,Gp-LEA基因编码蛋白与花旗松LEA蛋白亲缘关系最近。荧光定量PCR分析显示,Gp-LEA基因在复水和快速干旱模式下均能表达。推测Gp-LEA基因在毛尖紫萼藓的复水和干旱过程中起着重要作用。     

一个新的人类睾丸特异基因的cDNA克隆和表达分析

运用“数据库消减杂交”(DigitalDifferentialDisplay)方法筛选人类睾丸特异表达新基因 ,获得了有差异显示的代表新基因的克隆重叠群 ,挑选其中一个克隆重叠群HS .12 9794进行多组织RT PCR ,初步证实该重叠群在人睾丸中有高表达。然后从包含该重叠群的IMAGE克隆出发 ,采用生物信息学的方法快速克隆了一个人类新基因的全长cDNA序列 ,其全长 2 4 30bp ,开放阅读框为 6 76～ 12 4 8bp ,定位于 3p2 1 1,编码由 190个氨基酸组成 ,分子量为 2 0 4 17 8Da ,等电点为 5 2 3的一个偏酸性蛋白质 ,该蛋白与已知蛋白质无明显同源性。克隆实验验证该基因阅读框完全正确 ,半定量RT PCR进一步显示该基因在人不同发育时期的睾丸及精子细胞中有表达 ,推测其可能与精子生成相关 ,暂命名为SRG5 (TestisSpermatogenesisRelatedGene 5 ,SRG5 ) (GenBank登录号 :AY2 2 1117)。SRG5基因的成功克隆表明 ,“数据库消减杂交”与实验验证相结合的技术路线是一种快捷高效的发现更多人类功能新基因的新策略。     

绵羊肌球蛋白轻链2基因的分子克隆与表达分析

肌球蛋白轻链2蛋白是哺乳动物肌球蛋白的重要成员之一。获得其基因序列,并对其特征和表达进行分析,可为进一步研究功能奠定基础。本研究以小尾寒羊背最长肌为试验材料,采用RACE等方法对绵羊肌球蛋白轻链2基因的cDNA序列进行克隆和测序、利用相关生物学软件对所得cDNA序列进行生物信息学预测、并利用qRT-PCR和Western印迹法对其在绵羊各种组织中的表达进行分析。结果获得该基因cDNA序列全长为776 bp,提交至GenBank中获得相应的登录号为KJ710702;该序列中的498 bp的开放读码框编码含有166个氨基酸残基的蛋白质。预测发现该蛋白质无信号肽和二硫键,但存在N-糖基化和磷酸化位点;二级结构中以α-螺旋为主;蛋白质序列比较发现绵羊MYL2与小鼠、人、大鼠、猪、牛等哺乳动物的同源性均在95%以上。mRNA和蛋白质表达谱均显示该基因在绵羊心肌中表达量最高,其次为背最长肌。     

草鱼cadm2b基因的克隆及在成体组织中的表达分析

为研究CADMs（Cell adhesion molecules）在草鱼构建抵御病害感染的第一道防线中发挥的作用,用RT-PCR和RACE方法结合测序分析,在草鱼脑组织中检测到了该基因家族成员cadm2b基因的4条不同的cDNA全长序列。序列比对结果表明这4条全长cDNA在5'端的序列完全相同,在3'端的3个局部区域有不同片段的缺失。因此,可以确定这4条不同的mRNA是cadm2b的不同剪接体。这4条不同的剪接体被分别命名为cadm2b、cadm2bX2、cadm2bX3和cadm2bX6。cadm2b的cDNA序列全长1669 bp,开放阅读框（ORF）1203 bp,编码400个氨基酸。cadm2bX2的cDNA序列全长2783 bp,开放阅读框长1323 bp,编码440个氨基酸;cadm2bX3的cDNA序列全长2755 bp,开放阅读框1296 bp,编码431个氨基酸;cadm2bX6基因的cDNA序列全长2649 bp,开放阅读框1161 bp,编码386个氨基酸。根据碱基序列所进行的氨基酸序列和蛋白结构预测显示这4个CADM2b蛋白亚型都具有CADM家族保守的4个功能区,但其C端的蛋白结合位点存在差异。CADM2b具有近膜4.1蛋白结合位点和Ⅱ型PDZ蛋白结合位点,CADM2bX2、X3缺失了PDZ蛋白结合位点,而CADM2bX6则同时缺失4.1蛋白和PDZ蛋白的结合位点。实时定量RT-PCR检测结果显示cadm2b剪接突变体是该基因mRNA的主要形式。半定量RT-PCR和套式PCR实验检测结果表明cadm2b基因在草鱼成体脑中高水平表达,在肝、肾、心脏和肌肉组织中有微量表达。这种表达模式提示草鱼中CADM2b主要是由非免疫细胞,而不是由免疫肥大细胞合成分泌的细胞黏附因子,可能通过介导免疫肥大细胞与病原靶细胞的黏附而起非特异性抵御病害感染的作用。     

疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶基因的克隆及其在毕赤酵母中的高效表达

疏棉状嗜热丝孢菌Thermomyces lanuginosus可产生具有重要工业生产价值的脂肪酶。根据已报道的相应序列设计特异引物,综合运用PCR、RT-PCR技术克隆到脂肪酶基因的全长DNA和cDNA序列。其中DNA序列长1071bp,包含876bp的开放阅读框以及3段内含子;cDNA序列长885bp。结构基因编码蛋白包含292个氨基酸,前17个氨基酸构成信号肽。序列提交GenBank,登录号分别为EU022703和EU370914。将脂肪酶基因cDNA序列的开放阅读框克隆到酵母分泌型表达载体pPIC9K中,转化毕赤酵母GS115得到重组子且实现了分泌表达。将重组子诱导产酶,在培养温度30℃、甲醇添加量1%的情况下,小规模发酵量达0.93mg/mL,其分泌表达的最高酶活为7.2U/mL。重组酶最适反应温度和pH分别是60℃和8.0。表达蛋白在60℃保温1h后仍有完全酶活,具有较高的热稳定性。     

肿瘤MUC1/Y的克隆及其胞外段在大肠杆菌中的可溶性表达、纯化和鉴定

为获得MUC1 Y全长cDNA及其胞外段蛋白 ,以用于进一步的生物学功能及肿瘤生物学治疗的研究 .利用RT PCR从HeLa细胞中扩增MUC1 Y全长cDNA ;PCR扩增其胞外段 ,克隆到原核表达载体pGEX 2T ,转化DH5a菌 ,诱导表达 ;亲和层析纯化 ;凝血酶酶切、GST活性及N端蛋白测序鉴定 ;免疫家兔制备多克隆抗体 .所得MUC1 YcDNA的开放读框为 759bp ,登录于GenBank(AF12 552 5) .其信号肽编码序列缺失 9bp ,第 3 3 1位发生G A转换 ,造成缬氨酸突变为蛋氨酸 .表达获得约 4 0kD融合蛋白GST Yex ,占菌体总蛋白 2 5%～ 3 0 % ,其中 70 %～ 80 %为可溶性 ,经亲和层析一步纯化 ,纯度 >90 % ,GST比活性为 0 2 1U μg .凝血酶酶切后的N端蛋白序列测定表明与已知序列完全一致 ,抗血清ELISA效价为 1∶2 50 0 0 0 .结果表明 ,克隆到发生碱基缺失和突变的MUC1 Y全长cDNA ,获得MUC1 Y胞外段蛋白及其多抗 ,可进一步用于相关研究 .     

Molecular cloning and expression analysis of a new gene for short-chain dehydrogenase/reductase 9

We report here the cloning and characterization of a novel human short-chain dehydrogenases/reductase gene SCDR9, isolated from a human liver cDNA library, and mapped to 4q22.1 by browsing the UCSC genomic database. SCDR9 containing an ORF with a length of 900 bp, encoding a protein with a signal peptide sequence and an adh_short domain. GFP localization shows SCDR9 protein concentrated in some site of the cytoplasm, but not in the ER. Expression pattern in eighteen tissues revealed that SCDR9 is expressed highly in liver. Soluble recombinant protein was successfully purified from Escherichia coli using pET28A(+) expression vector. Our data provides important information for further study of the function of the SCDR9 gene and its products.     

蒙古牛BMPR-IB基因部分cDNA的克隆和序列分析

BMPR-IB基因主要在哺乳动物卵巢中表达,对卵泡的发育和分化起重要作用。该研究从影响卵巢生长发育和调控的BMPR-IB基因出发,以牛卵巢的RNA为模板,按照不同物种BMPR-IB基因的相似性设计特异引物,运用RT-PCR技术扩增并获得了特异片段,该片段经PCR、酶切和测序验证,证实所克隆序列为牛BMPR-IB序列,包含有953bp组成的部分cDNA序列,同源性分析结果表明,牛BMPR-IB基因序列与绵羊、山羊、人、猪、小鼠的BMPR-IB基因分别为98%、97%、92%、93%、88%的同源性。这为克隆其他物种的BMPR-IB基因提供了依据,同时牛骨形态发生蛋白的测序为更好地理解牛的生殖机理提供帮助。     

番茄花粉特异表达的高赖氨酸蛋白基因(tsb)的克隆与特性分析

赖氨酸是人和单胃动物必需的八种氨基酸之一,食物蛋白中的必需氨基酸种类不全或数量不足,都会影响其它氨基酸的利用.玉米等主要禾谷类作物由于缺少赖氨酸,种子蛋白利用率还不到50%.在长期以玉米为口粮的地区,人们往往患有营养不足或糙皮病.     

棉花PTS2受体基因(GhPex7)的克隆及表达分析

利用cDNA—AFLP差异片段F010,通过RACE延伸、EST、检索等方法获得了一个棉花过氧化物酶体定位信号2受体蛋白基因(peroxisomal targetingsignal type 2 receptor,GhPex7p)的编码序列。该cDNA包含一个954bp的开放阅读框,编码317个氨基酸,推测其等电点为5．603。同源性分析表明：推测GhPex7与拟南芥、酵母、果蝇、小鼠和人的Pex7p基因存在序列相似性,其中与拟南芥的同源性最高,为83％,并具有3段WD-40蛋白家族的保守域,与拟南芥AtPex7的编码蛋白同类。Southern杂交结果表明该基因在陆地棉基因组中存在两个拷贝。Northern blotting和RT-PCR分析表明该基因在棉花根、茎、叶、花、胚珠和纤维中均表达,但茎、叶组织中的表达水平明显高于胚珠和纤维。     

Molecular cloning of the black tiger shrimp (Penaeus monodon) elongation factor 2 (EF-2): sequence analysis and its expression on the ovarian maturation stage

The techniques of homology cloning and anchored PCR were used to clone the elongation factor 2 (EF-2) gene from black tiger shrimp (Penaeus monodon). The full length cDNA of black tiger shrimp EF-2 (btsEF-2) contained a 5' untranslated region (UTR) of 73 bp, an ORF of 2541 bp encoding a polypeptide of 846 amino acids with an estimated molecular mass of 95 kDa, and a 3( UTR of 112 bp. The searches for protein sequence similarities with BLAST analysis indicated that the deduced amino acid sequence of btsEF-2 was homological to the EF-2 of other species and even the mammalians. The conserved signature sequence of EF-2 gene family, GTPase effector domain and ADP-ribosylation domain were found in the btsEF-2 deduced amino acid sequence. The temporal expressions of gene in the different ovarian stages were measured by real time PCR. The mRNA expressions of the gene were constitutively expressed in ovary and different during the maturation stages. The result indicated that EF-2 gene was constitutively expressed and could play a critical role in the ovarian maturation stage.     

水稻葡萄糖-6-磷酸脱氢酶cDNA的电子克隆

电子克隆是基因克隆的新策略,以小麦胞质葡萄糖－6－磷酸脱氢酶cDNA(Tagpdl克隆）序列为信息探针,在GenBank水稻nr数据库中找到高度同源的水稻基因组序列,通过人工序列拼接及RT-PCR确认得到了水稻该基因的全长cDNA序列,命名为OsG6PDH,OsG6PDH与小麦Tagpdl克隆的DNA一致率为88％,推导的氨基酸序列与小麦,番茄,烟草的胞质葡萄糖－6－磷酸脱氢酶基因的一致率分别为89％,79％,80％,经RT－PCR表达谱分析,OsG6PDH在水稻幼穗,胚,根,叶中都有表达,在幼穗与根中表达略高,另外,讨论了利用水稻基因组信息的电子克隆方法克隆水稻功能基因的可行性。     

青岛文昌鱼过氧化氢酶基因的克隆及生物信息学分析

过氧化氢酶(catalase,CAT)是一类广泛存在于动物、植物和微生物体内的末端氧化酶,是生物体内抗氧化酶体系的重要成员,因此本研究旨在克隆文昌鱼CAT基因并对其进行生物信息学分析。本研究以青岛文昌鱼(Branchiostoma belcheri tsingtauense)为材料,用RACE技术首次克隆了其CAT全长cDNA的基因序列,命名为AmphiCAT(GenBank登录号:KU058636);该序列总长为2640 bp,开放阅读框(open reading frame,ORF)为1533 bp,编码510个氨基酸,含有一个长为19个氨基酸序列的潜在活性位点和一个长为9个氨基酸序列的血红素配体信号,总分子量在线预测约为57.85 kD;经生物软件分析确定该蛋白质无信号肽序列,预测该蛋白质为非分泌性蛋白,属于单功能CAT的clade3分支;该基因的分子进化树表明青岛文昌鱼CAT同软体动物的亲缘关系较近。     

新型小鼠淋巴组织特异性肌动蛋白结合蛋白相关序列cDNA克隆

 应用抑制性差减杂交技术 ( SSH)克隆两种不同小鼠胸腺基质细胞的差异表达基因 ,获得新基因片段 C55.通过 Gen Bank检索及 RT- PCR扩增出一个全长 1 .4kb的 c DNA.杂交分析认为它是一个完整的 c DNA序列 .c DNA序列分析表明 ,它拥有一个 636bp的开放读码框架 ,编码 2 1 2个氨基酸 .同源序列比较发现 ,它编码一个肌动蛋白相关蛋白的新成员 ,该序列与多种已知的肌动蛋白相关蛋白 SM2 2 α及其同源蛋白在氨基酸水平上有 62 %～ 95%的同源性 .Northern杂交分析显示 ,该基因 m RNA转录本在两种不同胸腺基质细胞中的表达存在显著差异 . RT- PCR分析显示 ,该基因特异表达于小鼠淋巴相关组织中 ,而在非淋巴组织中无表达 .