小鼠缺氧诱导丝裂原因子基因启动子的结构与功能分析

缺氧诱导丝裂原因子（hypoxia-induced mitogenic factor, HIMF）是一种肺组织特异性生长因子，可刺激肺细胞增生和再生，但HIMF基因表达调控的机制尚未明确．为探索HIMF基因转录调控机制，首先以小鼠基因组DNA为模板，通过PCR扩增方法获得－348～+61 bp、－302～+61 bp、－131～+61 bp、－68～+61 bp的HIMF启动子片段，再将其定向克隆入pGL3-Basic载体，构建荧光素酶报告基因载体，并制备转录因子ETS-1结合位点的突变或缺失体．在阳离子脂质体的介导下，报告基因载体分别瞬时转染正常氧浓度条件下培养的小鼠肺上皮MLE-12和MLE-15细胞、结肠癌CT26细胞．结果发现，各HIMF启动子片段在MLE-12、MLE-15细胞中均有活性，但在CT26细胞中活性缺失；－302～－131 bp区存在HIMF启动子的核心调控元件．针对该区域ETS-1转录因子结合位点进行突变或缺失，能导致HIMF启动子活性显著降低；凝胶电泳迁移率实验表明,该区段能结合ETS-1．结果提示，转录因子ETS-1参与正常氧浓度下HIMF启动子活性的调控，为研究HIMF基因的转录调控机制奠定了实验基础．     

小鼠睾丸特异表达基因TSEG-1的克隆及序列分析

从表达序列标签(expressed sequence tags, ESTs)数据库ZooDDD中获得小鼠正常睾丸表达的EST, 通过dbEST数据库检索出与其高度同源的EST序列, 构建EST叠加群(contigs), Biolign软件拼接, GeneScan软件预测contigs对应的基因组序列中的外显子、内含子; 针对开放阅读框设计引物序列, 采用RT-PCR从小鼠睾丸组织中克隆新基因的cDNA, 分析该基因在小鼠各脏器中的mRNA表达, 并对测序结果进行生物信息学分析。结果表明: 在小鼠X染色体的1 668~2 011 kb间克隆出一新基因TSEG-1, 全长为510 bp, 开放阅读框为336 bp, 编码111氨基酸, 分子量12.84258 kDa, 等电点11.4000。RT-PCR证实该基因开放阅读框正确, 在小鼠睾丸组织中特异性表达, 且与小鼠其他cDNA 无同源性, 获得GenBank 登录号EU079024。功能区分析发现TSEG-1蛋白可能为一种跨膜蛋白, 跨膜区位于第41~61氨基酸残基。TSEG-1基因与人类睾丸特异性组蛋白2a变异体基因有较高同源性, 在TSEG-1基因5′-端非编码侧翼预测发现存在1个启动子区域, 范围为680 bp。 TSEG-1蛋白可能有4个抗原性位点, 2个特异性蛋白激酶的磷酸化位点, 其亚细胞定位可能位于线粒体。小鼠睾丸特异性基因TSEG-1的克隆为进一步研究其生物学功能和表达调控奠定了基础。     

基于EST的新基因克隆策略

表达序列标签(expressed sequence tags, EST) 是从随机选择的cDNA 克隆进行单向测序获得的短的cDNA序列, 代表一个完整基因的一部分。随着生物信息学和基因定位的迅猛发展, EST已成为基因定位、基因克隆、基因表达分析的有力工具。近年来, 由于EST数据库的迅速扩张, 运用EST来克隆和定位基因, 使得新基因克隆的策略发生了革命性变革。尽管存在一些不足, 实践证明EST可大大加速新基因的发现与研究。本文将就EST技术尤其是它在新基因克隆中的应用策略作详细介绍。