毛尖紫萼藓GpUCH基因克隆及表达分析

从毛尖紫萼藓干旱cDNA文库中筛选了一条与抗旱相关的泛素羧基末端水解酶基因的EST序列,采用RACE技术从毛尖紫萼藓中克隆出了该基因的cDNA全长序列,命名为白UCH。对该基因的序列特征、进化关系和表达谱进行了分析,为全面研究其功能奠定了基础。该基因cDNA全长951bp,开放阅读框711bp,共编码236个氨基酸。生物信息学分析显示,印UCH基因相对分子质量为25．7kD,等电点为4．67,为不稳定蛋白,属于跨膜蛋白但不存在信号肽。系统进化树分析表明,GpUCH与小立碗藓UCH蛋白一致性较高。实时荧光定量PCR结果显示,GpUCH基因在复水和干旱的条件下均能表达,但是在不同的条件下表达情况差异显著。表明该基因可能在毛尖紫萼藓干旱过程中发挥一定的作用。     

毛尖紫萼藓泛素延伸蛋白基因克隆及序列分析

目的:该文首次从毛尖紫萼藓中克隆到泛素延伸蛋白基因的全长,为深入研究其功能打下基础。方法:提取植物的总RNA,经反转录得到cDNA,根据实验室得到的毛尖紫萼藓泛素延伸蛋白基因的EST序列设计引物,基于3’RACE(Rapid Ampli-fication of cDNA End)技术克隆得到全长序列,使用分子生物学软件进行序列分析。结果:获得了cDNA全序列,GenBank登录号为JQ659260,序列全长为673bp,开放阅读框为471 bp,编码156个氨基酸残基。结论:通过Blast P对其编码的氨基酸序列进行比对结果显示:毛尖紫萼藓泛素延伸蛋白与小立碗藓、北美云杉、葡萄、蓖麻、毛果杨、紫茎泽兰的泛素延伸蛋白的同源性均在96%以上。     

毛尖紫萼藓超氧化物歧化酶基因GpSOD的克隆及表达分析

超氧化物歧化酶(SOD)在植物中普遍存在,具有清除自由基、维持活性氧代谢平衡的功能,在植物抗逆中发挥着重要的作用。本研究以耐旱能力极强的毛尖紫萼藓(Grimmia pilifera)为试材,采用RACE技术克隆获得1个超氧化物歧化酶基因SOD的cDNA序列,命名为GpSOD(GenBank登录号:GU989312)。该基因全长726 bp,编码区为465 bp,编码154个氨基酸。序列分析表明:该基因编码蛋白是非分泌性疏水蛋白,具有2个铜锌超氧化物歧化酶位点,属于Sod Cu基因家族,与其他植物超氧化物歧化酶的同源性为68.8%~86.8%。实时定量PCR检测结果显示,虽然GpSOD在干旱及复水条件下均有表达,但GpSOD受干旱诱导表达明显,且复水处理抑制其表达,表明GpSOD蛋白与毛尖紫萼藓响应干旱胁迫的过程密切相关,该结果为进一步寻找高效抗氧化胁迫基因提供前提条件。     

砂藓生长素受体基因RcTIR1的克隆及表达分析

本研究我们试图利用PCR技术从砂藓中克隆TIR1基因的cD NA全长序列,对其进行了生物信息学分析,采用实时荧光定量PCR分析该基因在复水和干旱过程的表达情况。我们将砂藓转录组测序获得的生长素受体蛋白基因序列命名为Rc TIR1,基因cD NA全长为1 110 bp,开放阅读框(ORF)长度为615 bp,共编码204个氨基酸。生物信息学分析显示,该基因所编码蛋白理论等电点为5.70,不稳定指数为32.85,总平均亲水性为-0.027,无跨膜区和信号肽,亚细胞定位在细胞核。利用实时荧光定量PCR方法检测对该基因在砂藓复水和快速干旱过程中的表达模式显示在砂藓的复水过程和干旱处理中该基因均有差异性表达。通过研究砂藓生长素受体蛋白基因Rc TIR1与砂藓干旱胁迫的关系,为植物逆境胁迫机制的研究以及该基因的实际应用奠定基础。     

柠条锦鸡儿CkLEA4基因克隆及表达分析

LEA蛋白是一种与植物抗逆相关的胚胎发育晚期丰富蛋白。该研究从已构建的柠条锦鸡儿干旱胁迫抑制削减杂交文库中筛选到1条LEA蛋白编码基因的部分序列,用RACE技术扩增得到该基因cDNA全长并对其进行了克隆。测序表明该基因cDNA长870bp,其中开放阅读框长510bp,编码169个氨基酸,推测蛋白分子量为17.03kD,等电点为9.3,是一种亲水蛋白。序列比对和系统进化分析表明,该基因属于LEA4基因家族成员,命名为CkLEA4。实时荧光定量PCR检测发现,CkLEA4基因在干旱、ABA和NaCl处理下均受到不同程度的诱导,说明CkLEA4基因可能与柠条锦鸡儿响应逆境胁迫有关。     

毛尖紫萼藓干旱胁迫cDNA文库的构建

干旱胁迫是影响植物生长发育的主要环境因素,严重影响农作物的产量。解决这个问题的有效途径是培育和利用优良的抗旱品种。应用比较功能基因组学方法筛选抗旱相关基因,并通过基因工程培育抗旱品种已成为植物遗传资源与品种改良研究的重要内容。毛尖紫萼藓（Grimmia pilifera）是典型旱生藓类,生长在向阳的裸岩上,具有很强的抗旱能力,是很好的抗旱基因资源。本研究采用SMART技术构建毛尖紫萼藓干旱cDNA文库,文库滴度为2.8×10⁵ pfu·mL^-1,重组率为91.7%,插入片段大小为500~2 000 bp,平均为800 bp。通过测序我们获得了1 045条ESTs,其中高质量的996条,通过拼接获得875个Unigenes,为进一步筛选抗旱相关基因奠定了基础。     

纤枝短月藓LEA5基因表达及耐盐性分析

该研究以纤枝短月藓为材料,利用RT-PCR和HiTail-PCR技术分别克隆得到纤枝短月藓LEA5基因的ORF和启动子序列,并进行生物信息学、基因表达及耐盐性分析,为进一步研究LEA5蛋白的保护机制奠定基础。结果显示:(1)LEA5基因包含267 bp的开放阅读框(ORF),编码88个氨基酸。(2)LEA5基因启动子序列为1 053 bp,利用PlantCARE在线工具预测顺式作用元件显示,该启动子不仅具有典型的CAAT box元件,还含有ABRE、MYB、MYC、MYB结合位点(MBS)等其他元件。(3)荧光定量分析表明,LEA5基因在纤枝短月藓不同时期和不同组织中都有表达。(4)LEA5蛋白的异源表达提高了大肠杆菌对盐胁迫的耐受性,表明LEA5蛋白可能在耐盐性中起重要作用。     

高粱LEA3蛋白基因和启动子的克隆及序列分析

根据禾本科LEA3基因保守序列设计简并引物,同时结合RACE方法获得高粱LEA3基因全长cDNA序列1032bp,该序列含有一个612bp的阅读框,编码203个氨基酸,包含7个串联的LEA3蛋白的基元序列。通过与玉米、小麦、水稻、大麦的LEA3蛋白序列比较,氨基酸序列同源性分别为73.8%、53.77%、45.63%和53.99%;其编码蛋白理论相对分子量为21.22kD,等电点pI=8.79;蛋白质二级结构预测表明2段α螺旋结构占主导,与目前已知的多种植物的LEA3蛋白具有相似的结构功能域。通过热不对称交错PCR(TAIL PCR)技术获得LEA3基因启动子749bp的DNA序列,该区域包含ABA应答元件、干旱胁迫应答元件、以及胚胎和胚乳特异表达元件;通过PHyML软件构建了禾本科植物LEA3基因ML系统树。这些研究结果为深入了解该基因的功能和高粱抗旱的分子机理提供了基础数据。     

小桐子JcLEA4基因克隆及表达和功能分析

LEA蛋白是一类跟抗逆性紧密相关的蛋白,在不同物种中都有大量发现。基于前期对小桐子叶片在干旱锻炼和干旱胁迫下的RNA-seq分析,本研究分离出一个LEA编码基因(XM_012232372.1),经序列分析可知该蛋白基因CDS序列全长为459 bp,编码蛋白由152个氨基酸组成。多重序列比对和进化分析显示该蛋白属于第四组典型亲水性LEA蛋白,暂命名为Jc LEA4。荧光定量PCR分析发现,幼苗叶片中Jc LEA4转录本的积累受到空气干旱胁迫和外源ABA处理的显著诱导。在酿酒酵母中异源表达分析显示,Jc LEA4的过表达提高了转基因酵母对PEG模拟干旱胁迫的存活率和生长速率,表现出增强的耐受性。本研究初步证实了Jc LEA4基因与抗旱性紧密相关,为以后小桐子的抗旱性遗传改良提供了良好的基因资源。     

高温胁迫对毛尖紫萼藓生理生化特性的影响

本实验对毛尖紫萼藓进行60℃高温处理,研究高温胁迫对毛尖紫萼藓生理生化指标的影响。试验结果显示,毛尖紫萼藓的脯氨酸、可溶性蛋白和丙二醛含量,随着胁迫时间的延长,呈先升后降趋势;其可溶性糖和叶绿素含量呈下降趋势。在一定的时间下解除胁迫后,毛尖紫萼藓能够出现生长可恢复的现象。因此,本试验结果能够证明毛尖紫萼藓对60℃高温有抗性,短期高温对其伤害是可逆的。     

无芒隐子草CsPEAMT基因克隆及表达特性分析

以无芒隐子草(Cleistogenes songorica)干旱胁迫下的cDNA文库中磷酸乙醇胺N-甲基转移酶(phosphoethanolamine N-methyltransferase,PEAMT)基因的EST序列为基础,采用RACE方法克隆该基因编码区序列,该序列全长为2 104bp,开放读码框1 506bp,编码501个氨基酸。无芒隐子草PEAMT蛋白编码的氨基酸序列与多种植物的PEAMT氨基酸序列有较高相似性,其中与高粱SbPEAMT、玉米ZmPEAMT的蛋白序列相似性最高(93%),说明PEAMT基因在植物进化中非常保守。采用实时定量RT-PCR分析无芒隐子草幼苗在干旱过程中CsPEAMT基因的表达结果显示,干旱胁迫诱导CsPEAMT基因在根和叶中大量表达,且在干旱第8天时CsPEAMT基因在叶和根中表达量分别是未干旱对照的43.35倍和13.25倍,复水后CsPEAMT基因的表达量开始下调。研究表明CsPEAMT基因可能是无芒隐子草抗旱性相关的基因。     

铁皮石斛钙网蛋白基因DoCRT1的分子克隆与表达研究

该研究采用RACE克隆铁皮石斛钙网蛋白(calreticulin,CRT)基因DoCRT1,进行生物信息学分析,并借助定量PCR检测基因表达模式,为揭示该基因在铁皮石斛生长发育及逆境生理中的分子作用奠定基础。结果表明:(1)DoCRT1基因(GenBank登录号KT957551)cDNA全长1 672bp,ORF长1 275bp,编码一条由424个氨基酸组成的多肽,分子量49.05kD,等电点4.42,具有CRT蛋白保守的钙网蛋白/钙联接蛋白P结构域(205~320)和类伴刀豆球蛋白凝集素/葡聚糖酶结构域A(20~222)以及多个基序;蛋白N端含有一个信号肽(1~23)和一个跨膜区域(8~24),预测结果显示主要定位于细胞液泡、胞外,与多种植物CRT蛋白一致性很高(80%~87%)。(2)DoCRT1蛋白与OsCRT1/2、ZmCRT1亲缘关系近,聚在CRT进化树的CRT1/2分支。(3)qRT-PCR检测结果显示,DoCRT1基因转录本在石斛根中表达量较高,为叶中的2.23倍,且茎与叶中表达量无显著差异。     

独一味苯丙氨酸解氨酶基因的克隆与表达分析

以独一味叶片为材料,采用RT-PCR和RACE方法克隆了独一味苯丙氨酸解氨酶基因（PAL）的全长cDNA,命名为LrPAL基因。测序结果表明,LrPA L基因全长2 298 bp,含有1个2 145 bp的完整开放阅读框（ORF）,编码714个氨基酸。蛋白序列分析表明,其包含典型的PAL活性中心序列（GTITASGDLVPLSYIA）,与其他植物的PAL蛋白有很高的同源性。系统进化树分析表明,独一味LrPAL与唇形科植物的PAL蛋白聚为一类,说明两者的亲缘关系较近。用 Real-Time PCR方法检测发现,LrPAL基因在独一味的叶中表达量最高,茎中表达量最少。研究结果推测,从独一味中克隆获得的苯丙氨酸解氨酶基因（LrPAL）是典型的PAL家族成员,在独一味各组织发育过程中具有重要功能。     

中间锦鸡儿CiMYB68基因克隆及表达分析

该研究以中间锦鸡儿(Caragana intermedia)为材料,利用RACE技术克隆了CiMYB68基因的全长序列。对CiMYB68的基因组DNA和cDNA全长分析显示,CiMYB68基因无内含子,开放阅读框为852bp,编码284个氨基酸。预测CiMYB68基因编码的蛋白质等电点为8.95,分子量约为31 459.4Da。序列比对和系统进化分析表明,该蛋白和大豆的GmMYB68一致性最高,达到67%。构建了CiMYB68基因与GFP融合表达质粒,激光共聚焦显微镜观察发现,融合蛋白定位于细胞核。用实时荧光定量PCR技术对在不同胁迫条件下CiMYB68基因的表达检测结果表明,在干旱和低温处理下CiMYB68均受到不同程度的诱导,暗示CiMYB68基因可能与中间锦鸡儿响应逆境胁迫有关。     

沙田柚无机焦磷酸酶基因的cDNA克隆及序列分析

植物自交不亲和性是植物生殖过程中普遍存在的一种现象,是植物特异性识别并拒绝自身花粉或亲缘关系很相近的花粉的一种遗传机制。无机焦磷酸酶(inorganic pyrophosphatase,IPPase)在植物生长发育方面起重要作用。该研究根据沙田柚花柱消减文库中EST序列(无机焦磷酸酶基因内部片段),设计了2对特异引物5'-GSP1,5'-n GSP1,3'-GSP2 and 3'-n GSP2,通过SMART-RACE PCR技术从所构建的沙田柚花柱抑制性消减文库中克隆了沙田柚无机焦磷酸酶基因的c DNA全长序列,利用Blastn、DNAman和Expasy软件对所克隆的基因进行同源性分析,以及基因编码的氨基酸的分子量、等电点、疏水性等理化性质分析。结果表明:IPPase基因c DNA全长为1 136 bp(Gen Bank登录号为KF990474),开放阅读框(ORF)全长为654 bp,共编码217个氨基酸,包括170 bp 5'UTR和312 bp的3'UTR;编码的蛋白质的分子量为24.4 k Da,等电点为5.96;蛋白结构域分析显示沙田柚IPPase与焦磷酸酶具有相同的保守结构域;对沙田柚IPPase蛋白质序列进行疏水性分析,结果表明沙田柚IPPase基因编码的肽链中疏水性最大值约为3.21,最小值约为-2.98,属于亲水性蛋白,无跨膜区域;Blastn搜索的结果显示,沙田柚IPPase基因序列与多种植物的IPP基因高度同源;序列分析表明,沙田柚IPPase基因核苷酸的同源性与毛果杨(Populus trichocarpa)和橡胶树(Hevea brasiliensis)IPPase基因均为87%;氨基酸序列与克莱门柚(Citrus clementina)无机焦磷酸酶完全一致。该研究结果可为深入研究无机焦磷酸酶在沙田柚自交不亲和中的作用机理提供基础。     

麻竹miR172a靶基因DlAP2的克隆及其表达

为了解开花麻竹(Dendrocalamus latiflorus)的Dl AP2基因功能,采用RT-PCR和RACE技术克隆了mi R172a靶基因AP2同源序列c DNA全长,命名为Dl AP2。结果表明,Dl AP2基因c DNA全长为1729 bp,包含5′端非编码区81 bp、开放阅读框1464 bp、3′端非编码区160 bp和24个碱基的Poly A尾巴,在编码框靠近3′端130 bp处有1个高度匹配mi R172a的结合位点(CTGCAGCATCATCAGGATTCT)。Dl AP2编码487个氨基酸的蛋白,具有两个AP2结构域,属于AP2/ERF家族AP2亚家族的AP2组,与来自其它单子叶植物的AP2蛋白均有较高同源性。RLM-5′RACE分析表明,mi R172a主要在靶序列的第11~12个碱基之间剪切靶基因Dl AP2的mi RNA。q RT-PCR结果表明,麻竹花芽中Dl AP2基因的表达规律与mi R172a表达变化正好相反,证明mi R172a对Dl AP2基因的表达具有调控作用。     

青花菜BoSCL3基因的克隆和渍水胁迫下的表达特征分析

为了解SCL3 (scarecrow-like 3)基因的功能,从青花菜(Brassica olreacea var. italica)中克隆得到1个SCL3基因,命名为BoSCL3,其cDNA全长1 355 bp,编码446个氨基酸。BoSCL3分子量为49.96 kD,为疏水性蛋白,与油菜(B. napus)、芜菁(B. rapa)中SCL3蛋白的亲缘关系最近,同科植物的SCL3具有较高的同源性。荧光定量PCR分析结果表明,青花菜BoSCL3基因表达量随渍水胁迫时间延长先下降后上升,推测其可能参与渍水胁迫响应。这为探讨青花菜BoSCL3基因响应渍水胁迫的分子机制提供理论依据。     

罗汉果色氨酸转氨酶基因SgTAR2的克隆及表达分析

色氨酸转氨酶基因家族,是直接参与植物生长素生物合成途径的关键酶基因。该研究在罗汉果转录组测序的基础上,结合RACE技术克隆罗汉果色氨酸转氨酶基因SgTAR2的全长cDNA序列和DNA序列;并对其进行生物信息学分析和时空表达分析。结果表明:克隆所得SgTAR2的cDNA全长序列2078bp,最长ORF为1332bp,编码443个氨基酸,Gen Bank登录号为KU949381,其编码蛋白具有2个蒜氨酸酶保守结构域和多个5'-PLP结合位点,推测其可能参与催化色氨酸转氨基作用、化学防御作用、生长素生物合成等生物学过程;SgTAR2基因DNA长为4103bp,含有4个内含子和5个外显子,其内含子具有多个高水平转录调控因子和多个与激素、环境等胁迫响应相关的作用元件,暗示SgTAR2基因内含子协同调控罗汉果生长素合成、抗胁迫反应、形态发育等生物学过程。实时荧光定量结果显示,SgTAR2基因在罗汉果各组织器官均有表达,在雌蕊和15d幼果期表达量较高,暗示该基因参与罗汉果果实早期发育。该研究结果表明SgTAR2参与了生长素介导的罗汉果不同生长发育过程,特别对幼果及花的起始发育和器官形态建成等具有重要意义。     

柠条锦鸡儿F3H基因克隆及功能分析

柠条锦鸡儿为豆科灌木,对各种环境胁迫具有较强的适应能力,类黄酮是天然的抗氧化剂,花青素属类黄酮化合物,逆境胁迫会影响植物体内花青素的合成,而黄烷酮3-羟化酶(F3H)是花青素生物合成所必需的一种关键酶。该研究成功分离克隆了柠条锦鸡儿的F3H基因,命名为CkF3H。CkF3H基因的开放阅读框(ORF)为1095 bp,编码364个氨基酸,推测的蛋白质分子量为41.3 kDa,理论等电点为5.9。生物信息学分析发现,CkF3H基因序列与其它植物F3H有较高的一致性,推测CkF3H蛋白与其它植物F3H蛋白具有相似的功能。利用染色体步移法克隆得到CkF3H起始密码子ATG上游468 bp的启动子序列,PlantCARE软件分析表明,该序列具有启动子的基本元件CAAT-box和TATA-box以及多种与逆境胁迫相关的顺式调控元件。实时荧光定量PCR分析表明,CkF3H在柠条的根、茎和叶中均有表达,没有组织特异性;CkF3H的表达受低温、高盐、干旱和高温胁迫的诱导,并且在低温胁迫下,CkF3H的表达还受到光周期的影响。综上所述,研究结果表明CkF3H基因在柠条锦鸡儿适应低温、高盐、干旱和高温胁迫的过程中发挥作用。