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重组虎纹捕鸟蛛毒素Ⅰ在巴氏毕赤酵母中的表达及纯化 总被引:3,自引:0,他引:3
纹捕鸟蛛毒素Ⅰ是从虎纹捕鸟蛛粗毒中分离纯化,具有镇痛活性的肽类神经毒素。对巴氏毕赤酵母生产的重组HWTX-Ⅰ进行多步纯化,首先将分泌到培养上清的rHWTX-Ⅰ进行90%饱和度的(NH4)2SO4沉淀,再用截留分子量3kD的滤膜脱盐,再用CM阳离子交换层析分离,最后用C18反相层析脱盐纯化,真空干燥后得到的rHWTX-Ⅰ经Tricine SDS-PAGE,质谱鉴定,氨基酸组成分析,N-端序列测定及活性鉴定,证明已获得高纯度的重组HWTX-Ⅰ,摇瓶表达量约为80mg/L,约占总分泌量的23.6%,并对摇瓶发酵条件进行了优化,为利用基因工程方法生产HWTX-I的规模化生产及临床应用提供了证据。 相似文献
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重组人促红细胞生成素纯化工艺的优化 总被引:3,自引:0,他引:3
采用堆积床生物反应器,用无血清培养基培养分泌重组人促红细胞生成素(rhEPO)的工程细胞株ZK9703.所收集的上清,采用阴离子交换层析-反相层析-分子筛层析三步纯化工艺路线,分别用Q-Sepharose XL-C4-S-200(方法Ⅰ)和DEAE Sepharose FF-Source-S-200(方法Ⅱ)纯化3批产品,所得EPO纯度达98%以上,体外比活性大于1.3^10^5IU/mg。方法Ⅰ、方法Ⅱ纯化过程的EPO体外活性回收率分别为23.56%和28.57%。本纯化方法Ⅱ工艺纯化日程短,分离效果好,EPO体内、体外活性回收率较高,更适合于大规模生产重组人促红细胞生成素。 相似文献
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构建丙型肝炎HCV包膜蛋白糖蛋白的E2基因原核表达载体,获得大量重组HCVE2蛋白,进行E2蛋白的抗原性及潜在保护作用研究。通过RT-PCR从HCVRNA阳性血清标本中扩增出975bp(383~708)E2基因片段,PCR产物经EcoR I和Sall I双酶切后连接到经同样酶切的PET-41a原核表达载体上,转化到大肠杆菌BL21(DE3)菌株,经Amp筛选,得到阳性重组质粒PET41a-HCVE2菌株,并以IPTG诱导蛋白表达,SDS-PAGE鉴定,表达产物经固定化金属配体亲和层析纯化,用ELLSA方法检测生物学活性。结果表明,构建的HCVE2包膜蛋白基因片段原核表达质粒所表达产物主要以包涵体形式存在,表达的融合蛋白与HCV阳性血清具有较好的反应原性。以HCVE2融合蛋白检测患者阳性血清具有良好的抗原性,有望能提高HCV抗体检测试剂盒的检出率。 相似文献
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运用数据库消减杂交筛选出一个在小鼠睾丸中特异表达的新基因--mtIQ2 (Genbank Accession No: DQ153247), Northern blot结果表明该基因的cDNA序列全长为1.2kb,小鼠多组织RT-PCR结果表明:该基因在睾丸中特异表达,而在其他组织中没有表达.运用隐睾模型对该基因的表达研究表明:在手术后第9d,该基因表达急剧下降,到18d完全消失.这些实验提示该基因在睾丸的发育和性成熟过程中可能起重要作用. 相似文献
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大鲵免疫分子CD9的克隆与鉴定 总被引:1,自引:0,他引:1
CD9是4次跨膜蛋白家族成员,对机体的免疫调控发挥着重要作用.本文首次报道了大鲵CD9的鉴定及其对免疫刺激的应答.大鲵CD9(Chinese giant salamander CD9, cgsCD9)由232个氨基酸组成,被4个跨膜结构域分割成1个胞内环、2个胞外环和2个短的胞内末端,这是4次跨膜蛋白的主要结构特征.1个糖基化位点NDS、1个CCG模体和7个半胱氨酸残基保守地存在于cgsCD9.cgsCD9与其它脊椎动物CD9具有最高77%氨基酸序列一致性,并与两栖动物CD9归属一族.实时定量RT-PCR结果显示,cgsCD9在大鲵中分布广泛,脾脏组织的表达水平最高,并且脂多糖能显著提高cgsCD9 mRNA的表达.过表达于Jurkat细胞中的cgsCD9能促进核因子κB的活化以及白介素-6的表达,而cgsCD9的作用在CCG模体突变为AAA后几乎丧失.上述结果表明,cgsCD9在大鲵抵抗细菌的免疫应答中发挥重要作用. 相似文献
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为了寻找毕赤酵母表达虎纹捕鸟蛛毒素-Ⅰ(HWTX-Ⅰ)时产生不均一性表达产物的原因,应用阳离子交换层析、反相HPLC、Tricine SDS-PAGE电泳、质谱等技术,对基因工程菌Pichia pastorisGS115/HWTX-Ⅰ表达的不均一产物进行了分离、纯化和鉴定,并对不均一产物的N端和C端进行测序,结果表明表达产物的不均一性主要体现在重组HWTX-Ⅰ的N端信号肽加工的不完全以及C末端的内部降解。生物学活性分析表明该不均一产物的活性仅为天然HWTX-Ⅰ活性的30%。同时,对如何避免不均一性表达产物的产生提出了相应的对策。 相似文献
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一个人类精子发生相关新基因TSARG7的克隆和初步功能研究 总被引:1,自引:1,他引:0
精子发生是一个多基因参与的复杂的生理过程,虽然人们克隆了一些与精子发生相关的基因,但迄今为止,人们对精子发生的分子机制了解有限,因而克隆相关的新基因,并研究其在理论上和实践上的功能仍然十分重要。该文从人类睾丸cDNA文库出发,以小鼠精子发生相关基因mTSARG7基因为电子探针,得到1个与人类的精子发生相关的新基因TSARG7(GenBank登录号为AY513610),该基因的cDNA全长为2463bp,含有12个外显子和11个内含子,定位在人类8号染色体8p11.21上。TSARG7编码的蛋白质含有456个氨基酸,分子量为56.295kDa,等电点为9.13,为胞浆中非分泌性蛋白,具有磷酸酰基转移酶(Hsc)的结构域,属于酰基转移酶家族的新成员,该家族成员具有脂质合成的功能。TSARG7和mTSARG7,TSARG7和Au041707分别具有97%的同源性。该基因在睾丸中特异表达,亚细胞定位在胞浆中表达。TSARG7 mRNA在13岁的睾丸中开始表达,并且随着精子的发生和性成熟而稳定增加,热应急实验显示该基因的表达与温度相关。综上所述,该文克隆了人的1个新基因,该基因与精子的发生和性成熟相关。 相似文献