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相似文献
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1.
克隆小鼠白细胞介素12(IL-12)p40及p35cDNA,并构建同时含mIL-12p40和p35cDNA的双顺反子真核表达载体及其在哺乳动物细胞中的表达.白细胞介素12是由巨噬细胞,树突状细胞等抗原提呈细胞产生的一种异二聚体细胞因子,对机体的细胞免疫功能起着重要的调节作用.利用脂多糖(100pg/ml)和小鼠重组干扰素(IFN-γ500U/ml)体外联合刺激小鼠腹腔巨噬细胞,从中提取总RNA,经RT-PCR扩增出含信号肽的小鼠白细胞介素12(mIL-12)p40及p35全长cD-NA.PCR产物经酶切后,分别克隆至pBluescriptⅡSK载体中,序列测定结果与文献报道序列一致.然后利用脊髓灰质炎(Polio)病毒内核糖体进入位点(IRES)连接mIL-12p40及p35cDNA,亚克隆至pcDNA3载体中,构建成含mIL-12p40及p35cDNA双顺反子真核表达载体,即pcDNA3/mIL-12,p40及p35cDNA同时受pcDNA3中hCMV启动子驱动,将p40及p35转录至同一mR-NA上.通过LipofectAMINE将pcDNA3/mIL-12转染COS-7细胞,72h收集培养上清,测定m  相似文献   

2.
戊型肝炎病毒(HEV)合成肽及基因重组抗原免疫反应性研究   总被引:2,自引:0,他引:2  
用ORF2、ORF3合成肽抗原(1~10号)及基因工程重组的ORF2抗原(1和2号)分别建立了酶联免疫方法(EIA),检测60份戊型肝炎病人血清中HEVIgG及IgM10个合成肽抗原(Sp1-Sp10)及2个重组抗原(Re1、Re2),均和HEV阳性血清发生特异反应,但阳性率和反应强度差别很大。以Re1(ORF2,402~660)检测的抗体阳性率最高,为96.7%(58/60);Sp6(ORF3,88~123)次之,为93.3%(56/60);以上两种抗原混合使用阳性率为100%(60/60)。Sp6、Re1及这两种抗原混合使用检测抗HEVIgM,阳性率分别为18.3%(11/60)、66.7%(40/60)和66.7%(40/60)。研究结果表明:合成肽6号(Sp6)及重组抗原1号(Re1)是制备戊肝抗体诊断试剂的理想抗原。  相似文献   

3.
双倍体酵母细胞D7经单核能为11.4MeV/u的An和U离子辐照后,测定了细胞随剂量的存活率和突变率。获得细胞对Au和U离子的失活截面分别为2.54μm2和1.92μm2。在存活率为37%的条件下,Au、U离子的RBE分别为0.28和0.19。在突变实验中,研究了DNA断链后的重组与倒位,它们对Au和U离子的截面为:8.3×10-2μm2[σm-rec(Au)],9.5×10-5μm2[σm-rec(U)]和6.1×10-4μm2[σm-rev(Au)]和3.8×10-5μm2[σm-rev(U)].最后,对所获结果进行了讨论。  相似文献   

4.
采用3H-TdR参入法,测定碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、胰岛素和内皮素-1(ET-1)对体外培养的大鼠肾小球系膜细胞(MC)增殖的影响,以及胰岛素与bFGF或ET-1促MC增殖的协同作用。结果表明,不同浓度的bFGF(5-200ng/ml)和胰岛素(0.1-2.4U/ml)均显著升高MC的3H-TdR参入值(cpm值)(P<0.01)。ET-1对MC的cpm值的影响依剂量不同呈现两种不同的效应,在10-9-10-7mol/L时,随着浓度的升高,MC的cpm值明显升高(P<0.01),并以10-8mol/L作用最强;当升高到10-6mol/L时,MC的cpm值出现降低趋势。胰岛素与bFGF或低浓度ET-1(≤10-8mol/L)共同作用于MC时,MC的cpm值明显高于二者单独作用之和(P<0.01),与高浓度ET-1(>10-7mol/L)共同作用于MC时,MC的cpm值小于二者单独作用之和(P>0.05)。上述结果说明,胰岛素、bFGF和ET-1均能显著促进MC增殖;胰岛素与bFGF或低浓度的ET-1促MC增殖具有正协同作用,与高浓度ET-1呈现负协同作用。  相似文献   

5.
天花粉蛋白Y14F/R22L定点突变及其活性研究   总被引:1,自引:0,他引:1  
利用多聚酶链式反应(PCR)技术,对天然天花粉蛋白(nTCS)基因在Tyr14和Arg22两个保守残基处同时进行定点突变,即Tyr14变成Phe,Arg22变成Leu,然后克隆到pET-8c高效表达载体上,构建成重组质粒pETY14F/R22L.经序列分析,定点突变的结果与预先设计的完全一致,突变后的天花粉蛋白命名为Y14F/R22LTCS.将pETY14F/R22L转化到E.coliBL21(DE3,pLysS)中,进行表达.经CM-SepharoseCL-6B柱纯化,SDS-PAGE鉴定,纯度可达90%.RIP活性测定显示,Y14F/R22LTCS的活性比nTCS降低了7.5倍,活性变化不显著,因此,TCS的Try14和Arg22对维持其活性部位构象并不是必需的.但由于Y14F/R22LTCS在E.coli中的表达量与nTCS相比明显下降,因此,Tyr14和Arg22可能与TCS翻译后的折叠有关.  相似文献   

6.
观察血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)对心肌肌浆网Ca2+,Mg2+-ATPase基因(SERCA2a)转录调节的影响,评价DMP811对此效应的干预作用.6周龄雄性SD大鼠随机分为3组,每组6只.组1:生理盐水输注;组2:AngⅡ输注+DMP811管饲(3mg·d-1·kg-1);组3:AngⅡ输注(200ng·min-1·kg-1.1周后称其体重,取心脏并称重,提取心脏总RNA后采用Northernblot的方法检测SER-CA2a的转录水平,采用RT-PCR检测AngⅡ1型受体(AT1)mRNA水平.实验后,组3心重(CW)、心重/体重(C/B)、AT1受体转录水平均高于组1(分别增加4.7±0.4%,4.9±0.9%和24.7±3.5%;P<0.01),而SERCA2a基因转录水平显著低于组1(降低20.1±3.0%,P<0.01),并且SERCA2amRNA水平与AT1受体mRNA水平呈负相关(r=-0.74,P<0.01).AngⅡ导致的上述改变能被DMP811完全阻断.AngⅡ通过其Ⅰ型受体的介导,诱导了SERCA2a的转录下调  相似文献   

7.
我们以往的工作证实成年自发高血压大鼠(SHR与SHRsp)肠系膜动脉由乙酰胆碱引起的内皮依赖性舒张(EDR)减弱。为进一步探讨EDR减弱的机制,本文观察了一氧化氮(NO)合成酶抑制剂左旋硝基精氨酸(L-NNA)及EDRF灭活剂还原型血红蛋白(RHb)对卒中易感型自发高血压大鼠(SHRsp)与常压对照(WKY)大鼠肠系膜动脉ACh内皮依赖性舒张(EDR)的影响。发现L-NNA(10(-3)mol/L)可使SHRsp弱于WKY的AChEDR(10(-8)-10(-5)mol/L)的差异消失,RHb(10(-5)mol/L)则仅在10(-7)-10(-8)mol/LACh时使SHR(sp)肠系膜动脉EDR弱于WKY的差异消失。将WKY在加入L-NNA后的与加入RHb后的ACh(10(-8)-10(-5)mol/L)EDR进行比较,无显著差异。而将SHRsp在L-NNA后的与RHb后的ACh(10(-8)-10(-6)mol/L)EDR进行比较,则有显著差异。并且,SHRsp的有内皮肠系膜动脉条对RHb的敏感性与WKY接近,对L-NNA的敏感性则低于WKY。表明高血压时肠系膜动脉内皮依赖性舒张减弱中,EDRF机制与  相似文献   

8.
用5-Fu治疗MT/p210bcr-abl转基因小鼠的研究   总被引:1,自引:0,他引:1  
以5-氟脲嘧啶(5-fluorouracil,5-Fu)腹腔注射治疗了12只携有金属硫蛋白(Metalothionein,MT)启动子和增强子序列、bcr-ablcDNA(p210)序列及SV40剪切和Poly(A)信号序列的转基因慢粒白血病(chronicmyeloidleukemi-a,CML)MT/p210bcr-abl小鼠,于治疗的第5d及第10d从不同脏器提取总RNA、DNA及蛋白质,分别进行PCR分析、RT-PCR检测被转移基因的表达水平及免疫沉淀法分析p210bcr-abl转基因产物的激酶活性.结果表明,被转移基因在脾脏和骨髓中表达水平较高,胸腺和肾脏中呈低水平表达.5-Fu活体治疗10d后,被转移基因的表达水平及其表达产物的激酶活性均被明显抑制  相似文献   

9.
用丙型肝炎病毒重组蛋白C33_c抗原免疫BALB/c小鼠,运用杂交瘤技术成功地建立了7株能稳定分泌抗C33_c单克隆抗体的杂交瘤细胞1H6D2、2G1A6、3A4A8、3E3E7、4G12C10、4A10C2、5F4B6.试验结果表明,7株McAbs具有良好的HCV特异性,间接ELISA法测得小鼠腹水McAb效价为1:10 ̄4-1:4×10 ̄4;竞争抑制实验和相加指数测定证实7株McAbs识别相关的抗原表位;7株McAbs中1株为IgM(5F4B6),其它6株为IgG(2a)。  相似文献   

10.
利用PCR扩增得到粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、白细胞介素-3(IL-3)完整基因片段,将其分别克隆pGEM-T构建成GM-CSF/IL-3融合蛋白基因,DNA序列与设计预期一致。将得到的融合蛋白基因克隆对72RNA聚合酶表达载体pT7zz,得到表达质粒pFu,经转化至表达宿主E.coli BL21(DE3),在IPTG诱导下获得融合蛋白目的产物的直接表达。经SDS-PAGE电泳鉴  相似文献   

11.
报道了缢蛏碱性磷酸酶(简称ALP)经不同浓度盐酸胍处理时酶的分子构象所发生的变化以及酶变化和失活的动力学过程。在胍中酶荧光发射峰强度下降,紫外差光谱在246nm和285nm处出现2个负峰,CD谱中酶的α螺旋度下降,且随浓度增大,变化程度也加大。动力学研究表明,酶在0.5mol/L、1.0mol/L、2.0mol/L3.0mol/L、4.0mol/L盐酸胍中的变性速度常数分别为3.21×10~(-4)s~(-1)、6.38×10~(-4)s~(-1)、2.17×10~(-3)s~(-1)、2.33×10~(-3)s~9-1)、5.17×10~(-3)s~(-1);而酶在相应盐酸胍中的失活速度常数分别为2.33×10~(-4)s~(-1)、3.57×10~(-4)s~(-1)、5.86×10~(-4)s~(-1)、1.14×10~(-3)s~(-1)、3.45×10~(-3)s~(-1);表现为失活与构象伸展变化基本平行。  相似文献   

12.
由于精胺(spermine)能特异地刺激哺乳动物tRNA~(Ile)的氨基酰化,本文用纯化的牛肝tRNA~(Ile)观察了精胺和Mg(2+)对tRNA~(Ile)CD光谱的影响。结果显示:Mg(2+)可使牛肝tRNA~(Ile)CD光谱峰向短波方向偏移2nm,波峰为263nm,峰值被增大约10%,ΔθMg(2+)=2.3×103deg·cm2/dmol;而精胺使牛肝tRNA~(Ile)CD光谱峰减少40%,Δθspermine=1×10(-4)deg·cm2/dmol;精胺和Mg(2+)对肝tRNA~(Ile)-IleRS复合物或IleRS的CD光谱基本无影响。表明Mg(2+)和精胺可影响牛肝tRNA~(Ile)的构象。实验同时以酵母tRNA(Phe)和E·colitRNA~(Ile)作为对照。  相似文献   

13.
以人胃癌细胞BGC-823为模型,研究了毛喉萜(forskolin)对胃癌细胞中蛋白激酶C活性及其亚类基因表达的作用,同时也观察了毛喉萜对癌基因c-jun及抑癌基因p53表达的影响.结果表明,2×10~(-5)mol/L毛喉萜处理BGC-823细胞72h,细胞质、膜和细胞核PKC活性下降,PKC亚类β,γ基因表达被抑制,癌基因c-jun的表达也明显降低,而抑癌基因p53表达升高,上述变化可能是毛喉萜抑制胃癌细胞增殖等生理效应的重要分子事件。  相似文献   

14.
研究了辣根过氧化物酶在三种表面活性剂(SDS,TritonX-100及CTAB)的水相胶束中催化联苯胺聚合反应的动力学。结果表明水相胶束体系有利于反应的进行。辣根过氧化物酶在水相胶束体系中遵循米氏反应,K_m在SDS、TritonX-100及CTAB三种体系中分别为3.014×10~(-4)mol/L、1.728×10~(-4)mol/L和5.664×10~(-5)mol/L。由于微环境的不同,HRP在三种体系中表现出不同的最适反应温度和最适pH。  相似文献   

15.
Using a new immunoradiometric assay (ELSA pS2 Cis-France), a total of 200 cytosols obtained from primary breast tumors were examined for pS2 content, which is an estrogen-regulated protein actually studied as a marker of hormone sensitivity and favorable prognostic factor in breast cancer. In our patient group, the median pS2 value corresponding to 5.3 ng/mg of cytosolic proteins was used as cutoff. pS2 content was not related to menopause status, tumor size, or nodal involvement, whereas a positive correlation was found between pS2 and ER/PgR status. Moreover, the association of pS2 with steroid receptors seems to identify subgroups of patients better than ER/PgR alone.  相似文献   

16.
促甲状腺素(TSH)通过甲状腺细胞膜上的TSH受体(TSHR),产生第二信使cAMP,从而激活cAMP反应性起动子,而使相应的基因获得表达.实验结果表明,在构建有TSHR和糖蛋白激素cAMP反应性起动子以及萤光素基因(Luc)的转染细胞中,经补肾益精中药固真方提取液(1×10~(-4)稀释)处理3~5d后,可下调TSHR基因的表达,并使TSHR数目减少.提示固真方可调整甲状腺细胞的功能,或许有利于调整甲状腺机能亢进.  相似文献   

17.
18.
We developed and characterized an estrogen-responsive and ER-positive murine breast cancer cell line (MAC51) from a spontaneous breast cancer animal model. These cells are overexpressed with K8, K18 and K19 proteins in an immunofluoresence assay. Upregulation of ER alpha was observed in the immunofluoresence assay, real-time PCR analysis and western blot assay. A colocalization experiment in MAC 51 showed cytoplasmic colocalization of K18 and K19 proteins with ER ??. Real-time analysis of tumor samples from engrafted animals, MAC 51, metastatic liver and metastatic ovary revealed overexpression of K8 and K18 compared to the respective controls. A hormone responsive experiment in immunodeficient mice showed highly significant decreases in estrogen and tumor volume after 14 days ovariectomization. The tumorogenicity assay showed higher (3?×?10 5) and lower (3?×?104) concentrations of MAC 51 cells that developed tumors within 2?weeks post-transplantation. Tumor morphology and histology resembled a sarcoma pattern but our spontaneous model appeared in an adenocarcinoma pattern. Metastasis to different organs occurred through hematogenous and lymphatic routes. We assessed the potency of the anticancer effect in MAC 51 cells by treating various anticancer drugs with E2, followed by studying apoptotic gene expression profiles. E2 and E2+ tamoxifen-treated cells showed upregulation of apoptotic genes caspase 1, 3, 9, P53 and Bcl-xl but the tamoxifen- and paclitaxel-treated cells did not upregulate the apoptotic genes. Tamoxifen-resistant, ER-positive and high metastatic potential cell lines from murine origin are very rare. Also, estrogen greatly induced apoptosis in this cell line, hence MAC 51 has a greater application potential to evaluate low doses of estrogen with other targeted therapeutic drugs to treat breast cancer.  相似文献   

19.
人血浆纤连蛋白(Fibronectin,Fn)与人胎盘纤连蛋白两者在肽链结构上基本相同,但人血浆Fn的N-糖链结构为二天线结构,而人胎盘Fn不仅N-糖链的数量增加,同时还含有多天线结构,分别用~(125)I标记这两种具有不同糖链结构的Fn,观察两者与HT1080细胞的饱和结合的亲和性,结果发现,在4℃,人血浆Fn与HT1080细胞的饱和结合为129ng/10~5细胞,解离常数为2.83×10~(-8)mol/L,人胎盘Fn与HT1080细胞的饱和结合为133ng/10~6细胞,解离常数为2.64×10~(-8)mol/L.因而,人血浆Fn与人胎盘Fn上N-糖链的不同并未影响其与受体的结合.  相似文献   

20.
采用联合亲和层析法从人小脑及红细胞膜中纯化了AChE,纯化的人脑及红细胞AChE在SDS-PAGE上呈一主带,分子量约为66000。人脑AChE制备酯酶与酰胺酶比活性分别为1299与143U/mg,人红细胞AChE制备分别为4584与747U/mg。人脑及红细胞AChE制备的酯酶与酰胺酶活性最适pH较接近,在pH7.5-8.0之间,酯酶活性底物ATCh对其芳基酰胺酶活性有抑制作用。IC_(50)分别为10.2×10~(-3)及3×10~(-3)mol/L。梭曼对其酯酶及酰胺酶活性均有明显抑制作用,说明二者均需活性中心丝氨酸参与。  相似文献   

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