细胞污染及检测鉴定

细胞作为重要的实验模型广泛应用于各类实验,几乎所有科研实验室中都需进行细胞培养。细胞培养过程中最大的威胁就是细胞污染,凡是混入细胞培养环境中,对细胞生存有害的成分和造成细胞不纯的异物都应视为污染。细胞一旦遭到污染,所有的实验结果都会变得毫无意义。因此,及时检测并鉴定出所培养的细胞是否被污染至关重要。该文总结了细菌污染、真菌污染、支原体污染、细胞交叉污染和鞘氨醇单胞菌污染这五类细胞污染及其检测方法,并提出了相关污染的预防措施及几种常见清除方法以供参考。     

细胞培养物中污染支原体的去除

经小鼠体内、体外加用不同的抗菌素处理及克隆的方法处理细胞污染的支原体,三株细胞经两次、一株细胞经三次处理后,经培养法、ＤＮＡ染色法及ＰＣＲ法检查支原体污染均为阴性,并证明对其抗体分泌没有任何影响,不失为一个理想的去除支原体的方法,从而使有重要应用价值的支原体污染细胞的应用成为可能。     

EPO工程细胞株支原体检测

支原体污染是细胞培养过程中最常见的问题之一,对细胞支原体的检测是细胞特性鉴定的重要方面。我们采用抗支原体单抗免疫荧光法和培养法(包括液体培养法和固体培养法)检测工程细胞支原体。单抗免疫荧光法检测结果表明:支原体阳性的细胞膜表面有明亮荧光,工程细胞EPO C_2细胞膜表面无荧光。支原体液体培养法结果显示:作为阳性对照的支原体由于在生长过程中产酸使培养液变黄,而加入EPOC_2株细胞悬液的样品管与阴性对照管相同,无颜色变化。固体培养法结果显示:在显微镜下观察,支原体阳性对照在固体培养基上呈荷包蛋样集落,而阴性对照及EPO C_2株细胞样品均无菌落生长。以上结果表明:受检的EPO C_2株细胞未被支原体污染。     

用基因突变细胞检测支原体

支原体(Mycoplasma)污染培养细胞是细胞实验室中经常遇到的事,也是细胞生物学、免疫学、病毒学和细胞工程等相关学科的许多以培养细胞为材料的工作者们深感头痛的事。支原体感染细胞后,可在诸多方面对细胞的正常活性和功能产生影响,如有的支原体可使细胞产生严重的病变,导致细胞死亡。在病毒学研究中,有可能因支原体的污染而误导出错误的结论。另外,随着生物技术的迅猛发展,传代细胞用于疫苗、单     

支原体污染增加人肿瘤细胞外泌体生成并改变其小RNA表达模式

目的:研究支原体污染对肿瘤细胞外泌体生成的影响,探讨支原体导致的外泌体量和质的变化。方法:应用荧光显微镜及荧光共振能量转移观察支原体污染导致的胞内膜脂质向胞膜再分布及跨细胞传输变化,应用western blotting检测污染细胞上清中外泌体标记物CD81蛋白含量,应用芯片检测污染细胞上清外泌体中小RNA的表达变化模式。结果:支原体污染导致Rab11和胞膜脂质染料信号强度上升2倍以上,提示胞内膜脂质向胞膜再分布增强;支原体污染导致Di O和Di I双染细胞胞内膜泡的FRET指数上升4倍,提示膜脂质由支原体污染细胞向未污染细胞的跨细胞传输增强;污染细胞的上清中外泌体标志物CD81明显升高;污染导致外泌体内小RNA表达模式改变。结论:体外实验显示支原体污染可造成外泌体质和量的改变。     

支原体污染细胞的处理方法

<正> 在细胞培养技术中,支原体污染细胞系是一常见问题。受污染细胞的生长和代谢均受到影响,在用该细胞作免疫学试验时。就有可能产生异常结果.尤其在单克隆抗体制备中,污染支原体的骨髓瘤或杂交瘤细胞会导致融合失败或抗体分泌能力下降以至丧失。支原体污染细胞的危害之大,研究建立控制支原体污染的方法也就受到学者们的关注。     

细胞培养的支原体污染

<正>运用细胞培养进行病毒繁殖时,支原体污染是经常遇到的而且是非常严重的问题之一。这些污染对培养细胞产生各种各样的恶果:改变各种代谢活动致使不能进行培养细胞的正常生化研究;细胞生长速度减缓,迫使二倍体细胞系过早衰老,染色体发生畸变,并引起细胞形态的永久改变。事实表明:支原体污染虽会降低细胞培养中病毒的合成,但有时也能促进病毒的繁殖,这可能是支原体对干扰素产生的抑制。     

支原体污染防治研究的新进展

几乎对每一个用培养细胞为材料的工作者来说,支原体的污染都是一个极常见而又最棘手的问题,并日益得到普遍的关注。直至不久前为止,对支原体污染中的一些重要问题,特别是血清净化和污染细胞的救治问题都还没     

支原体和类菌质体是同物异名吗?

答:否。支原体(mycoplasmas)是1899年首次发现的,是一类有细胞形态,没有细胞壁的原核微生物,和L—型细菌很相似,寄生、共生或腐生。寄生的能致病,寄主是人类和动物,细胞间寄生,如人类支原体性肺炎病原(M.pneumonia)、牛胸膜肺炎病原(M.mycoids)等。支原体易人工培养,需要或不需要留醇,形成荷色蛋状的菌落。分类上将支原体作为细菌门下的一个纲——支原体纲(Mycoplasmae)。     

细胞培养中支原体污染的PCR检测

根据支原体16s rDNA序列,选择RemyTeyssou设计的三条寡核苷酸链,组成两套引物:P_(1-2a)能检测出细胞培养中常见的各种支原体,P_(1-2b)能检出无胆甾原体。反应可检出体系中10CFV的菌体。此法先用于对实验室人为污染支原体Vero细胞的检测,后与DNA 染色法和培养法比较,检测了49份生物样品,其中24份传代细胞,PCR检测的阳性率为58％,DNA染色法为42％,培养法为33％;三者的灵敏性比较,PCR可检出10~(-3)稀释度的阳性样品,高于其他两种方法。此PCR方法快速、灵敏、特异,适用于细胞培养中支原体污染的检测。     

癌症靶向基因-病毒ZD55-XAF1抗肝癌移植瘤的生长及其安全性研究

目的:探讨溶瘤腺病毒(ZD55-gene)作为载体携带外源抗癌基因(XAF1)抗肝癌移植瘤的生长及其安全性。方法:抽提溶瘤腺病毒ZD55-XAF1的基因组DNA,PCR扩增鉴定病毒;细菌平板培养和支原体检测试剂盒检测细胞有无细菌、支原体污染;通过荷瘤小鼠动物实验,观察溶瘤腺病毒ZD55-XAF1对肝癌移植瘤生长的抑制、小鼠的临床反应指标、血清肝毒性指标、各脏器组织中的病毒残留分布及病理切片观察。结果:细胞培养过程无细菌和支原体污染;较对照组,受试小鼠血清肝酶AST活性上升(P0.05),而ALT和ALP活性基本无变化(P0.05);PCR检测各脏器均有病毒基因组DNA存在;HE染色显示受试小鼠各脏器具有不同程度的损伤,病毒处理对肿瘤细胞具有明显的杀伤效果,而受试小鼠的临床反应并无明显异常。结论:溶瘤腺病毒ZD55-XAF1能够抑制肿瘤生长,杀死肿瘤细胞,对小鼠血清肝酶活性影响较小而对各脏器有不同程度的轻微损伤,作为癌症基因治疗载体有潜在的应用价值但其安全性还有待提高。     

猪鼻支原体(Mycoplasma hyorhinis)诱导NCI-H446等小细胞肺癌细胞在FIGNL1沉默时出现S期阻滞

【目的】研究支原体对体外培养细胞基因功能的影响。【方法】利用si RNA抑制DNA双链损伤修复关键基因——FIGNL1在无支原体感染、感染猪鼻支原体及清除支原体污染后的人小细胞肺癌细胞株NCI-H446与NCI-H1688中的表达后,采用定量PCR、流式细胞术等方法检测支原体感染对宿主细胞目标基因表达、细胞周期等影响。【结果】虽然猪鼻支原体感染对si RNA沉默FIGNL1表达无显著影响,无支原体感染及清除支原体污染的H1688和H446细胞FIGNL1表达沉默后,与仅加转染试剂的空白组(mock)相比较,靶标FIGNL1基因的实验组(T1)和阴性对照组(nc)的S期细胞比例均未发生显著变化。但猪鼻支原体感染的H1688和H446细胞相对于空白组,实验组与阴性对照组的S期细胞比例,H1688细胞提高了约1.38倍和0.51倍,H446细胞提高了约1.27倍和0.55倍。【结论】推测由于支原体会对宿主细胞DNA造成损伤,而FIGNL1是DNA双链断裂损伤修复的重要基因,从而导致沉默猪鼻支原体感染的H1688和H446细胞FIGNL1表达时,细胞会出现S期阻滞。鉴于支原体感染对细胞有广泛、显著的影响,在基因功能、肿瘤等细胞生物学研究中,应予以高度重视。     

支原体抑制宿主肿瘤细胞酪氨酸激酶受体c-kit降解

目的：研究支原体污染对宿主肿瘤细胞酪氨酸激酶受体c-kit降解的影响,探讨支原体污染对肿瘤细胞增殖的影响。方法：应用激光共聚焦荧光显微镜及透射电镜观察支原体污染HeLa细胞后内吞体的改变,间接反映外膜受体经内吞后的转运动力学改变：应用westernblot直接检测c-kit总量变化,泛素化水平及磷酸化水平;应用MTT法观察HeLa细胞污染支原体后细胞的增殖受到何种影响。结果：支原体污染后,内吞体聚集于核周,其膜表面积增大;支原体污染导致c—kit总量增加,同时泛素化磷酸化水平均增加,反映降解受抑制;支原体对肿瘤细胞增殖表现为双向影响,少量支原体污染促进HeLa细胞增殖,过量支原体污染则抑制增殖。结论：支原体污染在一定范围内可以通过抑制受体降解促进肿瘤细胞增殖,有可能是肿瘤进展中的一个加重因素,在将来需要引起临床工作者诊断和治疗上的重视。     

细胞培养中支原体污染的检测和去除

细胞培养过程中的支原体污染相当普遍。如何快速,简便地检测支原体,并且采取有效措施去除支原体一直是细胞工作者们亟待解决的难题。支原体检测方法有培养法,ＤＮＡ荧光染色法,单克隆抗体免疫荧光法。生化法,ＤＮＡ探针杂交法,ＰＣＲ法,支原体去除方法有药物法。免疫法,稀释法,加热法。本文就近年来有关支原体的检测及去除作一综述。     

人胚胎干细胞支原体感染的检测和控制

目的：优化检测人胚胎干细胞支原体感染的方法,寻找控制支原体感染的途径。方法：利用hoeshest33258染色检测感染支原体的人胚胎干细胞,接触感染培养基的人胚胎成纤维细胞,比较两种方法检测效果;利用RNApolymeraseⅡ作为新的鉴定指标,直接检测感染支原体的人胚胎干细胞;利用抗支原体药物对感染细胞进行处理,检测处理后细胞的感染状态。结果：hoechest33258染色后,受支原体感染人胚胎干细胞检测效果不明显,接触感染培养基的人胚胎成纤维细胞在培养7天后有拉丝状染色分布;RNApolymeraseⅡ染色则能直接检测出受感染的人胚胎干细胞表面粘附的支原体;利用抗支原体药物Plasmocin对感染细胞进行处理后hoechest33258拉丝状染色基本消失,但持续培养后重新出现。结论：间接法使用hoechest33258染色或者直接利用RNApolymeraseⅡ染色都能够很好地检测人胚胎干细胞培养过程中的支原体感染。抗支原体药物Plasmocin能够有效减轻支原体感染情况,但是不能完全杀灭支原体。     

人胚胎干细胞支原体感染的检测和控制

目的:优化检测人胚胎干细胞支原体感染的方法,寻找控制支原体感染的途径。方法:利用hoeshest33258染色检测感染支原体的人胚胎干细胞,接触感染培养基的人胚胎成纤维细胞,比较两种方法检测效果;利用RNApolymeraseⅡ作为新的鉴定指标,直接检测感染支原体的人胚胎干细胞;利用抗支原体药物对感染细胞进行处理,检测处理后细胞的感染状态。结果:hoechest33258染色后,受支原体感染人胚胎干细胞检测效果不明显,接触感染培养基的人胚胎成纤维细胞在培养7天后有拉丝状染色分布;RNApolymeraseⅡ染色则能直接检测出受感染的人胚胎干细胞表面粘附的支原体;利用抗支原体药物Plasmocin对感染细胞进行处理后hoechest33258拉丝状染色基本消失,但持续培养后重新出现。结论:间接法使用hoechest33258染色或者直接利用RNApolymeraseⅡ染色都能够很好地检测人胚胎干细胞培养过程中的支原体感染。抗支原体药物Plasmocin能够有效减轻支原体感染情况,但是不能完全杀灭支原体。     

细胞培养中的支原体污染问题(续)

6.放射性同位素自显影方法可用~(?)H标记的胸腺嘧啶脱氧核苷或尿嘧啶核苷自显影实验检查支原体的污染。此法的简单原理是:无污染的正常细胞在S期(DNA合成期)可摄取大量的胸腺嘧啶脱氧核苷到细胞核中。而当细胞被污染后,培养液的胸腺嘧啶脱氧核苷被支原体的嘌呤嘧啶核苷磷酸化酶     

马头山羊成纤维细胞系的建立与生物学特性分析

采用组织块贴壁培养法对马头山羊耳缘组织进行培养, 成功构建了马头山羊耳缘组织成纤维细胞系, 并对其形态学、生长动力学、细胞活力测定、中期染色体、微生物污染等特性进行了研究。结果表明: 培养细胞形态为典型的成纤维细胞, 细胞群体倍增时间(PDT)约为36 h。细胞冻存复苏后的活率为96.7%, 传代后生长状况与冻存前一致。细胞中期染色体二倍体(2n=60)占主体约为96%。微生物检测细菌、真菌、病毒支原体检测结果为阴性。细胞系各项指标均达到美国典型培养中心(ATCC)标准。此细胞库的建立在细胞水平上对马头山羊的遗传资源进行了保存, 也为今后的生物学研究以及体细胞克隆保种等研究提供了理想的实验材料。     

支原体检测多重定量PCR方法的建立及应用

目的:建立一种快速、准确的方法检测支原体,这不仅可以有效地减少和预防支原体污染,还能为科研工作者提供一定的指导价值。方法:利用荧光定量PCR(TaqMan探针法)检测支原体,反应体系中同时存在标记两种颜色TaqMan探针及相关引物,分别检测支原体DNA和参考基因模板。根据支原体16S核糖体RNA保守区和参考基因TOP3A保守区设计引物和探针。通过对引物浓度、探针浓度和退火温度等反应条件的优化,建立了TaqMan探针多重定量PCR方法,并对该方法的特异性、敏感性和重复性进行了验证。结果:建立的双色荧光探针定量PCR方法的标准曲线相关系数r2和扩增效率分别为0.995和113.36%;该方法最低检测限为10 copies/μL;组内及组间变异系数均小于1%,证明该检测方法高效。利用该方法对随机挑选90例细胞抽提DNA样本进行检测,结果有60例为支原体阳性样本,阳性率67%,阳性率与相关研究报道一致。检测3个细胞培养上清样本,结果 1例支原体阳性,2例支原体阴性。从检测的样本中随机选择3个阳性样本及2个阴性样本使用普通PCR支原体检测试剂盒检测,结果一致;将其测序,测序结果比对正确。结论:本研究建立的多重定量PCR支原体检测方法能够应用于细胞抽提DNA及细胞培养上清的支原体检测,可以实现高效、快速检测支原体污染。     

人红细胞生成素(EPO)工程细胞建立及特性分析

构建了EPO真核表达质粒,成功地实现了其在CHOdhfr-细胞中的表达,所得到的EPO工程细胞株的形态与CHOdhfr-细胞相似,细胞株小瓶静止培养时最高表达水平为2～3μg/106cells/24h,而且细胞表达稳定,连续传代三个月和反复冻存复苏三次,细胞表达水平无明显下降。经过对细胞的一系列特性分析表明,该细胞株无支原体、真菌及细菌污染,无致瘤性,形态正常,染色体畸变率与出发株相当。