微卫星在种公牛个体识别与亲缘鉴定方面的应用

采用美国ABI公司牛亲子鉴定试剂盒(Bovine Paternity PCR Typing Kit, 包括11个常染色体)和3个自选的Y染色体微卫星座位, 检测我国部分种公牛站肉用种公牛14个微卫星座位的多态性分布, 评估其遗传多样性, 并探讨其用于个体识别与亲缘鉴定的可行性。结果表明: 种公牛在14个微卫星座位中遗传多样性均较高, 其中MCM158座位的平均多态信息含量最高达到0.888, ETH10座位的最低, 为0.482。单个座位的个体识别能力在0.715~0.968之间, 累积个体识别能力为99.99%, 累计非父排除率达到99.99%, 表明采用的14个位点适用于个体识别和亲缘鉴定。     

我国体细胞克隆牛的研究进展

近年来,由于体细胞克隆技术在畜牧业生产、疾病治疗、生物学基础理论研究及濒危动物保护等诸多领域所蕴藏的巨大应用价值,克隆效率成为科学界研究的热点问题。本文对克隆技术的相关影响因素进行了综述,研究表明,不同细胞系影响到体细胞克隆牛效率,胎儿细胞和颗粒细胞重构胚的囊胚发育率、犊牛成活率比成年成纤维细胞高。关于卵母细胞和克隆胚胎冷冻保存的研究表明,玻璃化冷冻法可以用于克隆胚胎以及卵母细胞的冷冻保存。在此基础上,讨论了国际上哺乳动物体细胞克隆研究新进展和体细胞克隆的效率,指出体细胞克隆中亟待解决的问题。     

利用体细胞核移植技术生产表达绿色荧光蛋白的猪转基因克隆胚胎

以转染了质粒pEGFP-N1的猪胎儿成纤维细胞与体外成熟(in vitro maturation, IVM)的猪卵母细胞构建克隆胚, 比较了细胞转染后G418筛选与否, 卵母细胞IVM持续时间及IVM时氧分压高低对克隆胚早期发育的影响. 结果如下: (ⅰ) G418连续筛选10天所得转GFP细胞的克隆胚卵裂率显著低于非筛选组(47.5% vs. 71.6%, P<0.05), 而囊胚率差异不显著(10% vs. 10.4%, P>0.05); (ⅱ) 相比于36 h IVM, 延长IVM时间至 42 h卵母细胞的核成熟明显改善(83.6% vs. 96.7%, P<0.05); 另外, 虽然IVM 42 h也使得克隆胚卵裂率(59.3% vs. 73.6%)及囊胚率(9. 3% vs. 13.2%)都略有提高, 但效果不显著 (P>0.05); (ⅲ) 7%氧IVM 42 h 的卵母细胞与20%氧处理组相比, 克隆胚的卵裂率(70.6% vs. 67.1%)以及囊胚率(11.8% vs. 12.3%)差异都不明显(P>0.05). 上述结果显示: (ⅰ) G418筛选对转绿色荧光蛋白基因(GFP)克隆胚卵裂不利; (ⅱ) IVM 36和42 h的卵母细胞对克隆胚早期发育影响不明显, 但IVM 42 h有利于核成熟, 因此构建克隆胚时仍以IVM 42 h的卵母细胞为宜; (ⅲ) 低氧对猪转GFP克隆胚早期发育无明显促进作用.     

CRISPR/Cas9技术在表观基因组中应用的探讨

成簇规律间隔短回文重复序列/成簇规律间隔短回文重复序列关联蛋白9(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated proteins,CRISPR/Cas9)技术是近5年来在生物基因改造中应用最广泛的新型编辑工具,具有成本低、效率高、多位点打靶以及脱靶效应可预测等优点,正在成为不同生物体中设计基因组的有力工具。表观遗传的不断发展对分子生物学的中心法则提出挑战,包括DNA中碱基和组蛋白的修饰、非编码RNA对基因组和染色质结构的调节中都起到至关重要的作用。对CRISPR/Cas9系统的改造可以对表观基因组进行修饰。对CRISPR/Cas9系统在表观基因组中进行修饰的应用进行概述,讨论了定向修饰基因组存在的问题,以期为CRISPR/Cas9系统在基因组编辑领域的应用提供参考。     

一种适用于生产转染色体动物的微细胞制备方法

微细胞介导的染色体转移技术(MMCT)是一项将外源染色体转入哺乳动物细胞的技术,具有广阔的应用前景.与体细胞核移植技术结合,MMCT可用于生产具有重要医学药用价值和优良农业生产性状的转染色体动物.制备高质量的微细胞是关系MMCT技术成功的关键步骤之一.通过荧光染色和吉姆萨染色分析,结果表明,A9(neo12)细胞经0.2mg/L秋水仙素酰胺处理48h后,89%的细胞产生微核化,每个细胞平均形成10个微核.微核化的细胞在含有20mg/L细胞松弛B的Percoll密度梯度介质中,经39000g高速离心后,包含微细胞、完整细胞、细胞核和细胞碎片的混合液,依次通过8μm和5μm孔径的滤膜过滤后可获得纯化的微细胞溶液.通过光学显微镜和吉姆萨染色观察,可见微细胞为一群直径约为3～5μm的类细胞核的球形物质.微细胞PCR技术首次用于检测微细胞溶液的质量,检测结果显示,所制备的溶液中均匀分布着带有目的染色体的微细胞,适用于进一步作转染色体动物实验.     

马头山羊成纤维细胞系的建立与生物学特性分析

采用组织块贴壁培养法对马头山羊耳缘组织进行培养, 成功构建了马头山羊耳缘组织成纤维细胞系, 并对其形态学、生长动力学、细胞活力测定、中期染色体、微生物污染等特性进行了研究。结果表明: 培养细胞形态为典型的成纤维细胞, 细胞群体倍增时间(PDT)约为36 h。细胞冻存复苏后的活率为96.7%, 传代后生长状况与冻存前一致。细胞中期染色体二倍体(2n=60)占主体约为96%。微生物检测细菌、真菌、病毒支原体检测结果为阴性。细胞系各项指标均达到美国典型培养中心(ATCC)标准。此细胞库的建立在细胞水平上对马头山羊的遗传资源进行了保存, 也为今后的生物学研究以及体细胞克隆保种等研究提供了理想的实验材料。