小鼠卵巢几个重要发育事件的初步研究

选定多个阶段小鼠卵巢进行切片染色和生殖细胞计数统计等分析,以发现该阶段小鼠卵巢的发育特点。结果显示在胚胎发育第12.5 d的生殖嵴中,大部分的生殖细胞正进行有丝分裂增殖,并以生殖包囊的形式存在;在出生后第2 d的小鼠卵巢中,有大量紧密接触的原始卵泡,表明生殖包囊刚完成重组形成原始卵泡;在第5 d的小鼠卵巢中,原始卵泡仍占有大部分比例,但也有大量的初级卵泡处于发育之中;在出生后第10 d的卵巢中同时有原始卵泡、初级卵泡和次级卵泡的发育;老年小鼠(16个月大)卵巢中已基本没有卵母细胞。     

原始生殖细胞发生的机制

生殖细胞的发生是发育和遗传的基础。在几乎所有哺乳动物中,原始生殖细胞（primordial germ cell,PGC）均由近端上胚层体细胞在周边细胞特定的信号诱导下特化而成。目前的研究已经发现一些与生殖细胞特化有关的信号分子和关键转录调控元件,以及特化后生殖细胞获得的与体细胞不同的生物特性。生殖细胞的特化是一个结合了体细胞发育程序的抑制、细胞多能性程序的启动和全基因组表观遗传重编程三个方面的动态的复杂过程。多能性干细胞（胚胎干细胞或诱导型多能干细胞）具有发育全能性,能分化为机体任何一种细胞类型,包括生殖细胞。利用多能性干细胞体外分化形成生殖细胞有助于深入系统地研究配子发生的调控机制,为干细胞在不育症治疗方面的应用带来新希望。     

人诱导多能干细胞与人胚胎干细胞分化过程中Oct4/Nanog 基因 表达的比较

目的:比较通过慢病毒方法获得的人诱导多能性干细胞(iPSCs)与人胚胎干细胞(hESCs)分化过程中全能性基因Oct4、Nanog的表达变化。方法:收集分化不同时间点的拟胚体(EBs),检测三胚层分化基因以及全能性基因Oct4/Nanog的表达,并通过畸胎瘤组织切片的荧光染色分析Oct4的表达。结果:iPSCs获得的EB中内外三胚层分化基因表达的出现明显晚于hESCs来源的EB。不同于hESCs,iPSCs悬浮培养获得的EBs在体外培养18天未见内源性Oct4、Nanog基因表达的下调。未分化的iPSCs注射严重联合免疫缺陷(SCID)小鼠培养10周后获得的畸胎瘤中仍存在Oct4阳性的细胞,但iPS-#2中明显少于iPS-#5。结论:通过慢病毒方法获得的iPSCs虽然具有向三胚层分化的能力,但在分化过程中仍维持较高水平的全能性基因Oct4、Nanog的表达。     

利用化学小分子实现人胚胎干细胞多能性状态的转化

小鼠胚胎干细胞（Embryonic Stem Cells,ESCs）具有两种不同的多能性状态-原始态多能性（naive pluripotency）和始发态多能性（primed pluripotency）,这两种多能性干细胞在形态、自我更新维持条件、基因表达、表观遗传学特征以及单克隆形成率等方面都存在明显差别。传统条件下分离和培养的人胚胎干细胞（human Embryonic Stem Cells,h ESCs）生物学特征更接近始发态多能性状态,需依赖转基因操作才能获得和维持原始态多能性状态。本研究通过在培养体系中添加化学小分子成功地将已建系的始发态多能性h ESCs转化为原始态多能性干细胞,转化后h ESCs呈紧密、圆形、隆起的三维克隆结构,具有两条活化的X染色体,单克隆形成率提高,基因表达更接近原始态多能性特征。结果提示h ESCs也存在两种多能性状态,不同的体外培养环境可获得具备不同多能性特征的h ESCs。原始态多能性状态的获得使h ESCs在基因治疗、器官再生等领域具有广阔的应用前景,而仅改变培养条件,不依赖基因操作的培养方式大大提高了原始态多能性干细胞应用的安全性。     

人胚胎干细胞和分化细胞差别基因的筛选

人类胚胎干细胞(human embryonic stem cell,hESC)在增殖过程中如何保持未分化状态是干细胞生物学的核心问题之一,已有的LIF通路、Oct-4因子及Nanog基因的作用还不能对这一问题做出全面的解释。为进一步了解维持hESC未分化状态的机制,采用自行建立培养的hESC及分化的hESC细胞克隆(differentiated hESC,dhESC),应用抑制消减杂交(Suppression Subtractive Hybridization,SSH)结合反向cDNA斑点杂交技术,筛选出在hESC高表达、在dhESC中低表达或不表达的表达序列标签(Expressed Sequence Tag,EST)共105个。通过与GenBank比较,显示其中76个EST代表61个已知基因,18个EST代表15个假想基因,另有11个属于未知EST。选取其中8个克隆进行半定量RT-PCR分析,证实其中7个克隆在hESC中高表达,在dhESC中低表达或不表达。结果表明,hESC分化前后涉及多个基因的差异表达,对这些在hESC中高表达、在dhESC中低表达或不表达基因的进一步功能研究为阐明维持hESC未分化状态的机制提供了基础。     

从异常核型人胚胎干细胞中筛选不同X染色体失活状态的亚系

目的:从异常核型人胚胎干细胞系中分离两种不同X染色体失活(XCI)状态的细胞,建立亚系,并进行对其XCI状态特征和多能性标记进行鉴定。方法:G显带鉴定人胚胎干细胞系ch HESC-3早晚期代数细胞的核型,H3K27me3免疫荧光染色鉴定早晚期ch HESC-3表观遗传差异,RT-PCR检测早晚期ch HESC-3中XIST基因的表达。利用单细胞克隆的培养分选亚系,H3K27me3、RNA polymeraseⅡ以及DAPI三种标记的共染后每种表观标记各选两株进行RT-PCR,检测两种亚系中XIST基因的表达。并对这四株细胞进行干细胞标记鉴定。结果:G显带结果证明早期ch HESC-3为正常核型,晚期代数核型为异常核型,牵涉到8条染色体的复杂结构变异。H3K27me3免疫荧光染色证明异常核型ch HESC-3中有部分细胞出现了H3K27me3凝集点,而正常核型细胞中未发现。正常核型细胞(ch HESC-3N)没有XIST基因表达,异常核型细胞(ch HESC-3C)中有表达。在RNA polymeraseⅡ着色缺口中发现H3K27me3凝集点的细胞亚株XIST基因表达阳性,polymeraseⅡ着色缺口中未发现H3K27me3凝集点的细胞亚株XIST基因表达阴性,XIST阳性和阴性细胞各选两株进行多能性标记免疫荧光染色均为阳性。结论:成功从异常核型人胚胎干细胞系中分离两种不同XCI状态的细胞并建立亚系,两种表观类型的亚系均保持多能性标记并能在长期培养中保持各自特性。     

体外受精-胚胎移植中完全受精失败的原因分析

受精是生命起源至关重要的一个步骤。在辅助生殖的过程中,完全受精失败发生具有其复杂性和不可预见性。受精失败常伴随着一些胞间调控机制异常,其中,可能阻滞在与精子穿越卵冠丘复合体、精子-透明带结合/穿透、精子-卵膜结合、卵子激活、精子去浓缩或原核形成等任一阶段。通过卵胞浆内单精子注射可以避免大部分受精失败现象,但某些患者仍无法成功受精,即使采用辅助人工激活也无法完全避免其发生。对于在辅助生殖过程中完全受精失败患者,结合其卵子成熟情况、精子质量及相关检测结果,在后续周期调整临床方案可有效避免受精失败的再次发生。     

干细胞概述

干细胞是存在于胚胎和成体中的一类特殊细胞,它能长期地自我更新,在特定的条件下具有分化形成多种终末细胞的能力,不同来源的干细胞分化潜能各异。从早期胚胎内细胞团分离的胚胎干细胞能分化形成个体所有的细胞类型,并具有在体外无限增殖的能力,是最具有临床应用前景和研究价值的干细胞之一。在成体各种组织和器官中也存在成体干细胞,用于维持机体结构和功能的稳态。近期有关成体干细胞可塑性的研究和成体组织中多能干细胞存在的证据扩大了人们对成体干细胞分化潜能的认识。干细胞具有的多向分化潜能和自我更新能力使其成为未来再生医学的重要种子细胞,并成为研究人类早期胚层特化和器官形成、药物筛选以及基因治疗的最佳工具。     

不同人胚胎干细胞系向限定性内胚层分化能力存在差异

研究不同的人胚胎干细胞系向限定性内胚层细胞分化能力是否存在差异,并尝试寻找造成差异的原因.基于已建立的人胚胎干细胞库资源和限定性内胚层定向诱导分化体系,流式检测诱导分化3天后10株细胞系Sox17的阳性比率发现其值在60%到80%之间波动,而SSEA4的阳性比率在人胚胎干细胞系中不存在明显差异.基因表达谱结果显示像Sox17,Foxa2等内胚层标记在这些细胞之间不存在显著的差异,而像MEG3和SNORD114-3在差异细胞系之间和同株细胞早晚期代数之间存在表达差异.结果提示不同的人胚胎干细胞系向限定性内胚层细胞分化能力存在着差异,推测这些差异可能与MEG3和SNORD114-3的差异表达相关.     

视黄酸促进限定性内胚层细胞向胰腺前体细胞分化

研究视黄酸（RA）在限定性内胚层细胞向胰腺前体细胞诱导过程中的最佳作用方式。在无饲养层培养体系下联合多因子分阶段诱导经历10天时间获得胰腺前体细胞。获得的细胞不仅表达胰腺前体细胞的标记pdx1,但是也同时表达肝脏前体细胞的标记afp。有研究表明在胰腺特化过程中RA能起到抑制afp的作用,因此在不同的时间点添加RA并持续不同的作用时间来调节内胚层细胞向肝胰分化的命运。收集d7到d10的细胞用免疫组化和RT—PCR检测pdx1和afp的表达情况。结果显示RA从d3开始持续作用到d10可以获得更高的pdx1阳性细胞同时能有效的抑制afp的表达,并且在d9可以获得最高比率的pdxl阳性细胞,提示RA持续作用促进限定性内胚层细胞向胰腺前体细胞分化。