信号肽C—端和成熟蛋白N—端氨基酸序列的变化时α—淀粉酶分泌作用的影响

本文利用ｐＡｍｙ４１３质粒通过定点诱变技术,在α－淀粉酶基因的２８７和２９１位分别引入１个Ｇ和Ｃ,代替原来的Ｔ和Ｇ,构建成质粒ｐＡｍｙ４１３Ｂ,使成熟的α－淀粉酶Ｎ－端（７）Ｌｅｕ（８）Ｍｅｔ变为（７）Ａｒｇ（８）Ｉｌｅ。ｐＡｍｙ４１３Ｌα－淀粉酶信号序列因引入１个多酶切点接头而比ｐＡｍｙ４１３的２９个氨基酸增加了１３个氨基酸,创造了１个新的信号肽酶Ｉ识别窗口Ａｌａ－Ｇｌｎ－Ａｌａ↓Ｓｅｒ,利用计算机对该信号肽进行了二级结构分析。这两株突变株产酶能力分别为野生株（ｐＡｍｙ４１３）的３％和３６％;胞外α－淀粉酶的分子量同于野生株;末端分析显示,成熟酶第一个氨基酸为Ａｌａ,表明信号肽酶Ｉ在野生型识别窗口Ａｌａ－Ａｌａ－Ａｌａ↓Ａｌａ处切割。结果还表明,Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓα－淀粉酶在Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ中分泌作用属共翻译转移模型     

α—淀粉酶成熟蛋白N—端氨基酸序列变化对蛋白分泌的影响

从地衣芽孢杆菌（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）构建的重组质粒ｐＡｍｙ４１３,经过定点诱变,在α－淀粉酶基因的２７１位引入Ｇ取代原来的Ａ,构建成突变型质粒ｐＡｍｙ４１３Ｃ。成熟的α－淀粉酶氨基酸由＋２Ａｓｎ变为＋３Ａｓｐ,其产量是野生型的２．０２－２．５７倍;Ｎ－端氮基酸序列分析发现：信号肽酶Ｉ的切割位点前移了一个氨基酸,即ＡｌａＡｌａ－＋３Ａｓｐ;二级结构分析发现：在自由能为－５１．７ｋｃａｌ时,突变型与野生型的ｍＲＮＡ都形成１４个环状结构,区别在于２７１位的Ｇ不再与２１１位的Ｕ配对,形成Ｇ突出;蛋白质二级结构分析发现：３３－３７氨基酸的转角结构减少了１个氨基酸,这个氦基酸参与形成α－螺旋;这些空间结构和荷电氮基酸的变化有利于蛋白质的分泌。     

α—淀粉酶基因表达中启动子上游区EcoRI—BclI片段的生理功能

本文从ｐＡｍｙ４１和ｐＮＬ２０１出发,构建一系列α－淀粉酶基因上游区ＥｃｏＲｉ－ＢｃｌＩＩ片段的人或部分缺失的质粒,并构建了ｐＡｍｙ４１系列质粒ｐＡｍｙ４１系列、ｐＮＬ２０１系列双质粒工程菌,通过对这些工和力α－淀粉酶基因表达水平的分析显示,Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ α－淀粉酶基因上游区ＥｃｏＲＩ－Ｂｃｌｌ片段在α－淀粉酶基因表达中行使负的调控功能。     

GL—7—ACA酰化酶在大肠杆菌中的分泌表达

利用来自假单胞菌的ＧＬ－７－ＡＣＡ酰化酶的信号肽和表达元件基因片段构建了ＧＬ－０７－ＡＣＡ酰化酶的分泌型高表达质粒ｐＴｒｃＣＡ１Ｓ和ｐＫＫＣＡ１Ｓ,其中ｐＴｒｃＣＡ１Ｓ为ＩＰＴＧ诱导型质粒,ｐＫＫＣＡ１Ｓ为组成型质粒。ｐＴｒｃＣＡ１Ｓ和ｐＫＫＣＡ１Ｓ转入受体菌ＴＧ１中都可高表达ＧＬ－７－ＡＣＡ酰化酶基因并将表达产物转运到周质空间,完整细胞酰楷酶比活力分别为２３．９单位每克菌体和１８．３单位每克菌体     

α－淀粉酶基因表达中启动子上游区EcoRI－BclI片段的生理功能

本文从ｐＡｍｙ４１和ｐＮＬ２０１出发,构建了一系列α－淀粉酶基因上游区ＥｃｏＲＩ－ＢｃｌＩ片段缺失或部分缺失的质粒,并构建了含有ｐＡｍｙ４１系列单质粒ｐＡｍｙ４１系列、ｐＮＬ２０１系列双质粒工程菌。通过对这些工程菌α－淀粉酶基因表达水平的分析显示,Ｂ．Ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓα－淀粉酶基因上游区ＥｃｏＲＩ－ＢｃｌＩ片段在α－淀粉酶基因表达中行使负的调控功能。     

FEN—1基因反义阻断细胞株（FL—FEN—1^—）的建立

ＦＥＮ－１是一咱结构特异性核酸酶,它在ＤＮＡ复制和修复过程中都起着重要的作用。将ＦＥＮ－１基因的ＮｃｏＩ－ＢａｍＨＩ片段反向克隆到哺乳动物细胞重组表达质粒ｐＭＡＭｎｅｏＡｍｐ＾－中,得到ＦＥＮ－１反义表达质粒ｐＭＡＭｎｅｏＡｍｐ＾－ＦＮＢ＾－,并转染ＦＬ细胞,经Ｇ４１８筛选后,获得ＦＥＮ－１基因表达被阻断的哺乳动物细胞ＦＬ－ＦＥＮ－１＾－。对细胞生长曲线的测定发现,ＦＬ－ＦＥＮ－１＾－在地塞米松的     

可降解淀粉和产生酒精的酵母工程菌的构建

采用基因重组技术将黑曲酶糖化酶ＧＡＩ ｃＤＮＡ与ＭＦ－α１因子的启动子－信号序列及ＰＧＫ基因的转录终止位点重组进大肠杆菌－酵母穿梭质粒构建酵母表达载体ＹｅｐＭＧＴ２０,用原生质体转化法引入酒酵母ＧＲＦ１８,在酵母ＭＦ－α１启动子－信号序列及ＰＧＫ终止位点的调控下,实现糖化酶的高表达,９９％的酶活力分泌至胞外,构建的酿酒酵母ＧＲＦ１８（ＹＥｐＭＧＴ２０）在１０％淀粉的培养基中培养４８ｈ,淀粉水解率达     

选择作用下家鸡淀粉酶的遗传多态性研究—基因频率分化,相关效应估计和标

对“三黄”鸡４个品系的血液淀粉酶基因频率进行了估计,结果表明：Ａｍｙ－１基因频率具有明显的品系特异性,父系Ａｍｙ－１＾Ａ高;母系Ａｍｙ－１＾Ｂ频率。     

B8Gly在胰岛素结构模体中的可能作用

在胰岛素结构模体ｎ１－Ｃｙｓ－Ｇｌｙ－Ｘ１０－Ｃｙｓ－ｎ２－Ｃｙｓ－Ｃｙｓ－Ｘ３－Ｃｙｓ－Ｘ８－Ｃｙｓ－ｎ３中,有７个绝对保守的氨基酸残基,只有位于Ｂ８位的是Ｇｌｙ。通过定点突变将其改变为Ａｌａ,得到「Ｂ８Ａｌａ」人胰岛素,其受体结合能力和体内生物活力分别为天然猪胰岛素的２．５％和１０％。「Ｂ８Ａｌａ」人胰岛素和重组人胰岛素的远紫外圆二色谱比较表明,「Ｂ８Ａｌａ」人胰岛素的α－螺旋的相对含量有一家     

7号淀粉酶链霉菌M1033菌株葡萄糖异构酶在大肠杆菌中的高效表达

从已克隆的含７号淀粉酶链霉菌Ｍ１０３３菌株产葡萄糖异构酶基因的质粒ｐＵＢ中,用ＤｄｅＩ和Ｋｐｎｌ酶解,分离出酶结构基因,以平端方式与大肠杆菌质粒ｐＴ７-７连接,构建了重组表达质粒ｐＴＫＤ-ＧＩ。将ｐＴＫＤ-ＧＩ转化到特异大肠杆菌寄主Ｋ３８,经４２℃热诱导,所产葡萄糖异构酶占菌体可溶性蛋白３５％。通过ＤＥＡＥ－Ａ５０柱和Ｇ－１５０柱层析,发酵液可获电泳纯蛋白３４ｍｇ／Ｌ。     

TGF—β家族信号的细胞内传导蛋白：MAD蛋白家族

ＳＭＡＤｓ是新近发现的参与ＴＧＦ－β超家族的信号在细胞内声望地的一族蛋白,包括８个成员,分别称ＳＭＡＤ１－８。ＳＭＡＤ１、２、３、５和８属于一类,它们被ＴＧＦ－β的受体或ＢＭＰ的受体激活而磷酸化,称为受体调节ＳＭＡＤ,传导下ＴＧＦ－β或ＢＭＰ的信号。ＳＭＡＤ６和７属于另一类,它们抑制制受体调节ＳＭＡＤ的信号传导。ＳＭＡＤ４是第三类,它是受体调节ＳＭＡＤ传导信号的伴侣。受体调节ＳＭＡＤ传导信号必须先     

人血管内皮细胞生长因子受体Flt—1胞外区cDNA在毕赤酵母中的？…

将编码血管内皮细胞生长因子受体ＦＩｔ－１胞外区１－３ｌｏｏｐ３１６个氨基酸残基的ｃＤＮＡ插入到含ＡＯＸ１启动子和α分泌信号肽序列的Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ酵母载体中,构建了重组表达质粒ｐＰＩＣ９Ｋ／ＦＩｔ＝１（１－３）,转化酵母景菌ＧＳ１１５,筛选Ｈｉｓ＾＋Ｍｕｔ＾ｓ表型转化子,经插瓶培养,１％甲醇诱导表达４ｄ后,ＳＤＳ－ＰＡＧＥ结果显示,培养上清中ＦＩｔ－１（１－３）表达这总蛋白的３０－％     

一组丝瓜籽小分子核糖体失活蛋白LuffinS的分离,纯化 …

通过硫酸铵分级沉淀、ＣＭ－５２阳离子交换层析、ＨＲＬＣ分子排阻层析及ＦＰＬＣ Ｍｏｎｏ Ｓ离子交换层析等步骤,从丝瓜籽中分离到一组分子量为８ｋＤ左右的小分子核糖体失活蛋白－ＬｕｆｆｉｎＳ１、ＬｕｆｆｉｎＳ２、ＬｕｆｆｉｎＳ３。末端分析结果表明,它们的Ｎ端氨基酸分别为Ａｌａ、Ｐｒｏ和Ｔｈｒ。氨基酸序列分析确定了ＬｕｆｆｉｎＳ２的Ｎ端９个氨基酸的序列是Ｐｒｏ－Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ｇｌｎ－Ａｌａ－Ｐｈｅ－Ａ     

一组丝瓜籽小分子核糖体失活蛋白LuffinS的分离、纯化和性质

通过硫酸铵分级沉淀、ＣＭ－５２阳离子交换层析、ＨＲＬＣ分子排阻层析及ＦＰＬＣＭｏｎｏＳ离子交换层析等步骤,从丝瓜籽中分离到一组分子量为８ｋＤ左右的小分子核糖体失活蛋白——ＬｕｆｉｎＳ１、ＬｕｆｉｎＳ２、ＬｕｆｉｎＳ３。末端分析结果表明,它们的Ｎ端氨基酸分别为Ａｌａ、Ｐｒｏ和Ｔｈｒ。氨基酸序列分析确定了ＬｕｆｉｎＳ２的Ｎ端９个氨基酸的序列是Ｐｒｏ－Ａｒｇ－Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ｇｌｎ－Ｇｌｕ－Ａｌａ－Ｐｈｅ－Ａｓｐ。ＬｕｆｉｎＳｓ对核糖体的失活机制与天花粉蛋白（ＴＣＳ）一致,是ＲＮＡＮ－糖苷酶催化型的。它们对无细胞蛋白质生物合成的抑制活性较ＴＣＳ略强,ＩＣ５０分别为１．３×１０－１１、１．０×１０－１０和６．３×１０－１１ｍｏｌ／Ｌ左右。因此ＬｕｆｉｎＳｓ有可能开发成免疫毒素的高效“弹头”。     

簇毛麦低拷贝cDNA序列的克隆和鉴定

从簇毛麦叶片中提取总ＲＮＡ,进一步分离ｍＲＮＡ。以ｍＲＮＡ为模板反转录合成ｃＤＮＡ,两端经Ｔ４ＤＮＡ多聚酶修平后加ＥｃｏＲ１接头分子,连接于质粒ｐＧＥＭ－７Ｚｆ（＋）的ＥｃｏＲ１克隆位点,转化大肠杆菌ＪＭ１０３菌株建立了ｃＤＮＡ文库。用ＰＣＲ扩增重组质粒的ｃＤＮＡ插入序列,用＾３２Ｐ标记后分别与ＨｉｎｄⅢ或ＸｂａⅠ酶切的小麦－黑麦附加系ＤＮＡ进行Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交。根据其杂交结果,目前已鉴定出４     

兔防御素（MCP—1）cDNA的克隆与序列分析

从兔脾脏细胞中分离提取总ＲＮＡ,经反转录ＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ）扩增出兔巨嗜细胞阳离子多肽（ＭＣＰ－１）ｃＤＮＡ,插入经ＥｃｏＲ Ｉ和Ｘｂａ Ｉ双酶切的ｐＵＣＤ１９中,构建了党生质粒ｐＵＣＤＥＦ,进行了限制性酶切鉴定和序列分析,结果在扩增出的ｃＤＮＡ２８８个碱基中,在前片段中有一个碱基与发表的兔ＭＣＰ－１ ｃＤＮＡ序列不同,即第１５７位碱基由Ｇ变为Ａ,导致编码的氨基酸由丙氨酸变为苏氨酸。该ｃＤＮＡ全     

短芽孢杆菌α—乙酰乳酸脱羧酶基因在大肠杆菌中的克隆和表达

用ＰＣＲ方法扩增短芽孢杆菌α－乙酰乳酸脱羧酶基因,引入原核表达载体ｐＢＶ２２０中,得到重组质ｐＡＬＤ１．ｐＡＬＤ１的ＡＬＤＣ基因在大肠杆菌中高效表达,每毫升发酵液产酶８０单位以上,双原始菌株提高２００余倍。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ蛋白质分析表明,大肠杆菌ＤＨ５α表达的ＡＬＤＣ占细胞总蛋白量的４０％以上。研究了重组质粒稳定性,大肠杆菌ＤＨ５α和ＨＢ１０１分别大无选择压力下３０℃连续培养５０代以上,４１℃诱导     

地高辛精标记酪氨酸羟化酶RNA探针的制备研究

为制备用地高辛精（Ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ,Ｄｉｇ）标记的酶氨酸羟化酶（ＴｙｒｏｓｉｎｅＨｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ,ＴＨ）ＲＮＡ探针,本研究用分子生物学技术重组质粒ＰＧＥＭＴＨＩ,即分别将携带Ｔ７和Ｓｐ６启动子的ＰＧＥＭ－３ｚｆ质粒和携带ＴＨ基因的ＰＫＳＴＨ质粒用限制性内切酶消化并行分离纯化,得到带Ｔ７和ｓｐ６启动子的ＤＮＡ片段和ＴＨ基因片段;经Ｔ４ＤＮＡ连接酶连接后转入大肠杆菌,得到ｐＧＥＭＴＨ１重组克隆。经小量提取质粒井用酶切分析检测,证实其确有ＴＨ基因且方向正确。将此质粒再经限制性内切酶消化则得到线状ＤＮＡ片段,用Ｔ７ＲＮＡ聚合酶转录合成带有Ｄｉｇ标记的高比活度的单链ＲＮＡ探针;经斑点杂交试验证实该探针具有较高的可靠性。这将为基因治疗帕金森氏病动物模型的疗效检测提供有效手段。     

酶母K.cicerisporus基因组中有启动子功能的DNA片段的克隆

利用以３′－氨基糖苷磷酸转移酶基因（ＡＰＨＩ）为报道基因的一套启动子探针质粒ｐＳＫ－ｋａｎ４０１、ｐＳＫ－ｋａｎ１１０５、ｐＳＫ－ｋａｎ１２３８,从酵母Ｋｌｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｃｉｃｅｒｉｓｐｏｒｕｓ基因组中克隆到８个有较强启动功能的ＤＮＡ片段,分析出３′端ＤＮＡ序列,并在酵母Ｋｌｕｙｖｅｒｏ８ｍｙｃｅｓｅ ｌａｃｔｉｓ中通过检测报告基因与３－磷酸甘油醛脱氢酶基因（ＡＰＤＨ）的ｍＲＮＡ表达量的比     

牛生长激素基因的人工合成,重组克隆及高效表达

本文通过设计选择大肠杆菌高频利用密码子代替天然密码子,人工全合成３２个寡聚核苷酸片段;连接并克隆获得Ａ（２７８ｂｐ）、Ｂ（８８ｂｐ）、Ｃ（２２４ｂｐ）３个较大ＤＮＡ片段;经重组克隆、定位突变等获得阳性克隆;双向ＤＮＡ序列测定分析表明获得了两种人工全合成牛生长激素（ｂＧＨ）编码基因,即编码Ｎ－Ｍｅｔ－Ａｌａ－ｂＧＨ和Ｎ－Ｍｅｔ－Ｐｈｅ－ｂＧＨ的两个基因,而至今尚未见有人工全合成ｂＧＨ基因的报道。构建了在ＰＬｐｒｏｍｏｔｅｒ控制下含上述合成基因的表达质位ｐＢＬｂＧＨＥ７Ａ１和ｐＢＬｂＧＨＥ８,并在大肠杆菌中进行了温敏诱导表达。经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析,表达产物占全菌蛋白的３７％以上。Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ分析和纯化产物的Ｎ端氨基酸序列测定结果都表明上述两种人工全合成ｂＧＨ基因在大肠杆菌中得到了高效表达,表达量为现今国际文献报道的高限水平。