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三角酵母D—氨基酸氧化酶基因的克隆,测序及表达 总被引:1,自引:0,他引:1
利用跨越内含子的PCR技术,从三角酵母(Trigonopsisvariabilis)变种FA110中扩增得到D氨基酸氧化酶基因(daao),并通过TA克隆的方法将其克隆至pGEMT载体。序列测定结果表明,所得daao基因的5′端内含子已被删除,基因总长度为1071bp,它与Trigonopsisvariabilis的D氨基酸氧化酶同源性达983%,与Fusariumsolani和Rhodotorulagracilis的同源性分别是389%和308%。为提高表达水平,又将此基因转移至高表达载体pET28b上,在大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达。经IPTG诱导,目的蛋白的产生量可占菌体总蛋白量的46%,分子量约为38kD。D氨基酸氧化酶的活力可达802u/L。 相似文献
2.
大肠杆菌的phn操纵子与膦酸酯(Pn)的利用密切相关。实验利用PCR扩增、TA克隆等方法.获得了大肠杆菌phn操纵子中phnE、phnF和phnG基因的亚克隆,并进行了序列测定。通过P1噬菌体转导,构建了phnF的TnphoA’-9转座子插入突变体JW19,该突变仅对大肠杆菌的AEPn同化有微弱的影响,而利用phnE和phnG序列与染色体重组构建的phnF全缺失突变株JW67,则几乎不能在.AEPn培养基上生长。通过phnF基因的诱导高表达,用亲和柱层析分离纯化了PhnF。蛋白,达到电泳纯。并且用凝胶延滞的方法观察到,PhnF蛋白与加phn操纵子DNA片段相互作用后,可使凝胶图谱类型发生改变。 相似文献
3.
随着新的微生物资源不断被发现以及微生物基因组测序数据的积累和完善,目前研究重点和难点是如何从大量数据中快速发现和鉴定与微生物重要表型相关的功能基因,这就需要高通量的分析研究手段,主要涉及建库和筛选两个主要技术单元。其中,建库是指构建能够覆盖微生物全基因组的突变或干扰文库,所涉及的技术包括宏基因组、转座子插入突变、RNA干扰(RNA interference,RNAi)、反转录子文库重组工程(retron library recombineering,RLR)、CRISPR抑制(CRISPRi)和CRISPR激活(CRISPRa)等。筛选则是通过某种胁迫压力来促使文库菌群的差异化生长,并结合高通量测序全面发掘与特定表型相关的功能基因,从而为后续研究提供有效信息。本文对功能基因组学研究中现有的高通量分析技术进行了梳理、总结和展望,以期为这类技术方法的拓展、优化以及应用提供参考。 相似文献
4.
通常细菌间环型质粒在接合转移过程中,单链质粒DNA在质粒内部“oriT”接合转移起始位点发生缺刻.随后,打开的单链质粒DNA通过细胞膜的Ⅳ型分泌系统转移到受体菌中.但是,链霉菌中的接合型线型质粒带有游离3′端,5′端与末端蛋白结合,因而不能以细胞-细胞间方式转移单链缺刻DNA.报道了变铅青链霉菌线型质粒SLP2衍生的环型质粒,与SLP2一样可以高频高效接合转移,并鉴定了接合转移功能区.质粒有效的接合转移功能区包含6个共转录的基因,分别编码一个Tra样的DNA转移酶、胞壁水解酶、2个膜蛋白(可以与ATP结合蛋白相互作用)和一个功能未知的蛋白质.从SalⅠR-/M-向SalⅠR/M宿主转移的质粒频率下降表明,线型和环型的质粒都是以双链的形式转移的.上述研究结果表明SLP2衍生的线型质粒和环型质粒以相似的与细胞膜/胞壁功能相关的机理进行接合转移. 相似文献
5.
头状链轮丝菌(Streptoverticillum caespitosus)ATCC27422染色体复制起始区(oriC)内共有22个DnaA盒结构;其中第21、22个DnaA盒彼此方向相反、相互重叠8个碱基。放线菌oriC数据库搜索发现,这种重叠DnaA盒在抗生素链霉菌、结核分枝杆菌等几种放线菌中也同样存在。在分枝杆菌中一般由第1、2个DnaA盒组成,而在链霉菌中由最后的两个DnaA盒(第21、22)组成。重叠DnaA盒保守序列为CTGTGCACAA,长度为10个碱基,即由于重叠的缘故比正常DnaA盒长1个碱基。通过测量载体对变铅青链霉菌的转化效率研究了oriC不同部位在染色体复制起始中的功能和地位。头状链轮丝菌oriC序列的5′端1~188位的片段虽然不包含有DnaA盒结构,但该片段的缺失,造成oriC复制起始功能的完全丧失。3′端793~939位片段同样没有DnaA盒结构,该片段的缺失,仅发生转化效率的降低约40%,说明oriC的793~939位序列对DNA复制起始效率以及复制子稳定性起重要作用。当oniC被克隆人载体时两端各带有一段dnaA、dnaN基因的部分序列,所构建的载体虽然转化效率较低,但转化子的菌落、菌丝形态与宿主菌原有的表型相接近,由此推断oriC两端的序列除了编码各自产物外,可能通过影响染色体DNA复制的起始效率、复制子稳定性等对染色体的复制起始发挥顺式调控作用。 相似文献
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<正> 反刍动物的瘤胃中不存在腺体,消化酶完全来自于微生物。瘤胃降解的蛋白,除一部分为机体必需外,大部分被微生物浪费。因此,瘤胃微生物蛋白酶活力的高低直接影响饲料蛋白的利用率。目前,研究者们正寻找各种途径增加通过瘤胃的蛋白,但实验中常将微生物的整体作用和具体酶的作用相混淆,故本试验旨在提取瘤胃微生物胞外蛋白酶纯品,较全面地了解其性质和特点。 相似文献
7.
细菌磷代谢的分子调控 总被引:4,自引:0,他引:4
细菌的磷代谢通常是由一种两组分调节系统即磷酸盐调节子(Phoregulcn)所控制。所谓两组份调节系统,是指控制一大类细菌适应性反应、由结构和功能类似的两种同源蛋白族的成员组成的一类信号传导系统。其中磷酸盐调节子是研究较为深人的一种重要的两组分调节系统,它为细菌的正常磷代谢提供了保证。l细菌两组分调节系统两组分调节系统在细菌中是很常见的,目前已在十多种细菌中发现,仅在大肠杆菌中就可能有五十多种[1]。近年来,类似的传导系统在真核生物中也有发现,如酵母[2.3]和植物[4]一般说来,组成细菌两组分调节系统的两种蛋白分… 相似文献
8.
利用来自假单胞菌的GL-7-ACA酰化酶的信号肽和表达元件基因片段构建了GL-07-ACA酰化酶的分泌型高表达质粒pTrcCA1S和pKKCA1S,其中pTrcCA1S为IPTG诱导型质粒,pKKCA1S为组成型质粒。pTrcCA1S和pKKCA1S转入受体菌TG1中都可高表达GL-7-ACA酰化酶基因并将表达产物转运到周质空间,完整细胞酰楷酶比活力分别为23.9单位每克菌体和18.3单位每克菌体 相似文献
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戊二酰 7 氨基头孢烷酸 (GL-7ACA)酰化酶能够催化GL-7ACA分解生成 7-ACA ,后者是工业半合成生产头孢类抗菌素所需的重要前体。为了准确地检测GL-7ACA酰化酶及其突变体的表达 ,本研究通过构建一系列质粒载体 ,建立了两个简便有效地测定GL-7ACA酰化酶基因acy表达量的系统 ,从而可对酶的比活力进行定量。我们将两个报告基因 ,即儿茶酚双加氧酶基因 (xylE)和 β-半乳糖苷酶基因 (lacZ)分别置于acy基因的下游 ,使之与acy基因共用一个启动子 ,进行串联表达 ,各自构成一个多顺反子系统。实验证明 ,基因融合后的儿茶酚双加氧酶或 β-半乳糖苷酶的活力可以间接反映acy的表达量。 相似文献
10.
安普霉素是一类结构特殊的氨基糖苷类抗生素, 其分子中含一个稀有的辛二糖结构单元. 迄今为止, 尚无关于安普霉素生物合成途径及其前体化合物的完整报道. 研究发现, 向发酵培养基中添加甘氨酸和丝氨酸均可以出现在菌体生长保持基本不变的情况下促进抗生素产量的现象, 表明甘氨酸和/或丝氨酸可能参与了安普霉素的合成. [2-13C]甘氨酸示踪实验的核磁共振(NMR)检测结果表明, 甘氨酸专一地掺入安普霉素辛二糖环C7′-N甲基. 同时发现, 菌体胞内的S腺苷甲硫氨酸(SAM)水平上升与外加甘氨酸的量呈正比, 但是甲硫氨酸的加入会抑制安普霉素的合成. 据报道, 甲硫氨酸对结构中含有甲基取代基的抗生素, 如对rapamycin的 生物合成中转甲基过程有抑制作用. 由此推测, 尽管甲硫氨酸本身对抗生素产量呈抑制作用, 甘氨酸仍然可能通过甲硫氨酸循环提供甲基. 此外, [2-13C,15N]丝氨酸的示踪实验结果表明丝氨酸也可能作为安普霉素的限制性前体物参与了NH2的合成. 相似文献