Selection of substrate recognition sequence of protein kinase with ferric chelation affinity chromatography

Protein kinase substrate phage (PKS phage) was constructed by fusing the substrate recognition consensus sequence of cAMP-dependent protein kinase (cAPK) with bacteriophage minor coat protein g3p and by dis-playing it on the surface of filamentous bacteriophage fd. Phosphorylation in vitro by cAPK showed a unique labelled band of approximately 60 ku, which was consistent with the molecular weight of the PKS-g3p fusion protein. Some weakly phosphorylated bands for both PKS phage and wild-type phage were also observed. Phage display random 15-mer peptide library phosphorylated by cAPK was selected with ferric (Fe3 ) chelalion affinity resin. After 4 rounds of screening, phage clones were picked out to determine the displayed peptide sequences by DNA sequencing. The results showed that 5 of 14 sequenced phages displayed the cAPK recognition sequence motif (R)RXS/T. Their in vitro phosphorylation analyses revealed the specific labelled bands corresponding to the positive PKS phages with and without the typ     

拟南芥PKS5激酶点突变体外表达与磷酸化测试

PKS5(protein kinase SOS2-like 5)虽为拟南芥(Arabidopsis thaliana)中介导植物响应外界高p H的蛋白激酶,但其关键功能结构域尚未被确定。该研究用PCR对PKS5不同位置点突变形式进行克隆,并在原核系统中进行表达,得到PKS5不同的点突变蛋白;使用激酶通用底物MBP(myelin basic protein)及PKS5体内特异底物AHA2(A.thaliana isoform of the PM H+-ATPase,拟南芥质膜质子泵等位形式之一)对PKS5点突变蛋白磷酸化活性进行了测试。结果表明:点突变PKS5-2失去了激酶活性,PKS5-4、PKS5-5、PKS5-9自磷酸化与MBP磷酸化活性与PKS5相比无差异;而与PKS5相比,点突变PKS5-6和PKS5-7自磷酸化及对AHA2的磷酸化活性升高,且PKS5-7活性高于PKS5-6。说明PKS5特定位置点突变改变PKS5的自磷酸化及底物磷酸化活性水平,不同位置的点突变对其磷酸化活性的影响存在差异。研究结果可为确定PKS5功能结构域及体内作用机理提供依据。     

DNA损伤生物学反应中ATM对p21~(WAF1/CIP1)蛋白的直接磷酸化

毛细血管扩张性共济失调症突变蛋白 (mutatedinataxiatelangiectasia ,ATM)是直接感受DNA双链断裂损伤并起始诸多DNA损伤信号反应通路的主开关分子 .已有研究发现 ,DNA损伤生物学反应中 ,ATM可通过磷酸化活化p5 3,继而转录活化细胞周期检查点蛋白p2 1WAF1 CIP1的表达 ,而对于ATM是否直接参与p2 1WAF1 CIP1的早期活化迄今尚无实验证明 .通过免疫共沉淀反应 ,检测到细胞电离辐射 (ionizingradiation ,IR)反应早期ATM与p2 1WAF1 CIP1蛋白存在相互作用 .将p2 1WAF1 CIP1蛋白编码基因全长克隆入原核表达载体pGEX4T 2 ,经诱导表达及亲和层析纯化获取GST p2 1融合蛋白作为磷酸化底物 .体外磷酸化实验检测证明 ,IR活化的ATM具磷酸化p2 1WAF1 CIP1蛋白的功能 ,并且此磷酸化功能可被PI3K家族特异性抑制剂Wortmannin所抑制 .结果揭示了IR后ATM可通过直接磷酸化p2 1WAF1 CIP1蛋白 ,在IR致DNA损伤生物学反应早期调控p2 1WAF1 CIP1蛋白的快速活化过程     

日本血吸虫童虫裂解物对东方田鼠肝脏T7噬菌体展示cDNA文库的筛选及阳性克隆分析

东方田鼠对血吸虫具有天然抗性。为筛选和分析东方田鼠抗血吸虫抗性相关基因, 以日本血吸虫童虫可溶性裂解物为探针, 筛选东方田鼠肝脏噬菌体展示cDNA文库。经三轮筛选, 特异性噬菌体得到有效富集(375倍)。随机挑取92个克隆进行序列测定, 获得了19条有效EST序列。其中13个条EST序列与已知基因或表达序列标签同源, 6个EST序列与已知基因或表达序列标签均无同源性, 为新的表达序列标签。将19个EST序列的阳性噬菌体克隆和血吸虫童虫共培养, 其中4号(GenBank Accession No.: EW968294)、13号(GenBank Accession No.: EW968303)、14号(GenBank Accession No.: EW968304)、15号(GenBank Accession No.: EW968305)、18号(GenBank Accession No.: EW968308)克隆均诱导了显著的杀虫效果。综合生物信息学分析结果及体外杀伤试验结果, 编码CASP8和FADD类似性细胞程序性死亡调节蛋白、a-2-HS-糖蛋白、M4蛋白、具有R3H结构域的一种mRNA结合蛋白以及三种未知蛋白的编码基因(14、15、18号克隆)可能是东方田鼠抗血吸虫病抗性相关基因。为进一步研究东方田鼠抗血吸虫机理奠定了基础。     

日本血吸虫童虫裂解物对东方田鼠肝脏T7噬菌体展示cDNA文库的筛选及阳性克隆分析

东方田鼠对血吸虫具有天然抗性。为筛选和分析东方田鼠抗血吸虫抗性相关基因, 以日本血吸虫童虫可溶性裂解物为探针, 筛选东方田鼠肝脏噬菌体展示cDNA文库。经三轮筛选, 特异性噬菌体得到有效富集(375倍)。随机挑取92个克隆进行序列测定, 获得了19条有效EST序列。其中13个条EST序列与已知基因或表达序列标签同源, 6个EST序列与已知基因或表达序列标签均无同源性, 为新的表达序列标签。将19个EST序列的阳性噬菌体克隆和血吸虫童虫共培养, 其中4号(GenBank Accession No.: EW968294)、13号(GenBank Accession No.: EW968303)、14号(GenBank Accession No.: EW968304)、15号(GenBank Accession No.: EW968305)、18号(GenBank Accession No.: EW968308)克隆均诱导了显著的杀虫效果。综合生物信息学分析结果及体外杀伤试验结果, 编码CASP8和FADD类似性细胞程序性死亡调节蛋白、a-2-HS-糖蛋白、M4蛋白、具有R3H结构域的一种mRNA结合蛋白以及三种未知蛋白的编码基因(14、15、18号克隆)可能是东方田鼠抗血吸虫病抗性相关基因。为进一步研究东方田鼠抗血吸虫机理奠定了基础。     

Caspase-3 对磷酸化 tau 蛋白截断作用的研究

磷酸化 tau 是阿尔茨海默病 (Alzheimer's disease , AD) 的特征性病理改变———神经原纤维缠结 (neurofibrillary tangles , NFTs) 的主要组成部分 . 最近的研究显示： NFT 存在 Glu391 和 Asp421 位点被截断的 tau 片段,然而, tau 蛋白的磷酸化是否会影响 caspase-3 的切割作用尚不清楚 . 首先纯化重组 tau 蛋白,然后利用蛋白激酶 A (PKA) 、钙 / 钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ (CaMK Ⅱ ) 和乳鼠海马组织抽提液对其磷酸化,并用 caspase-3 对不同磷酸化的 tau 蛋白进行切割,比较 caspase-3 对非磷酸化和不同蛋白激酶磷酸化的 tau 蛋白的切割特性 . 结果显示：除切割非磷酸化 tau 蛋白外, caspase-3 在体外可分别切割被 PKA 、 CaMK Ⅱ和乳鼠海马组织抽提液磷酸化的 tau 蛋白 . 这一结果提示：磷酸化修饰的 tau 蛋白仍然是 caspase-3 的底物 .     

利用荧光标记的T7噬菌体研究配体/受体的相互作用

将鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV)衣壳蛋白VP2展示到T7噬菌体表面,以FITC标记纯化的重组噬菌体,通过荧光显微镜观察与流式细胞仪检测,研究标记噬菌体与病毒受体细胞--法氏囊B细胞的相互作用.结果展示有IBDV VP2蛋白的噬菌体经FITC标记后仍然具有与受体细胞结合的特性,荧光显微镜下可见绿色荧光,流式数据显示其平均荧光强度明显高于阴性对照,且IBDV疫苗株TAD可明显阻断其结合.由此得出结论,FITC标记与噬菌体展示技术相结合,可进行配体/受体间相互作用的研究.     

神经生长因子低亲和力受体(p75NTR)的模拟配基的筛选

人神经生长因子低亲和力受体 (p75NTR)转染R2细胞而建立的R2L1细胞 ,在去血清培养时发生凋亡 ,该作用可被神经生长因子 (NGF)所抑制 .用R2L1和R2两种细胞差式筛选噬菌体随机 7肽库和 1 2肽库 ,获得和p75NTR特异结合的噬菌体 .测定DNA序列后得到有关多肽的氨基酸序列 .7肽库共有序列为C (H D)LP(K M)HPM C ;1 2肽库优势序列为TLPSPLALLTVH .化学合成相应的 2个短肽 .用细胞结合法和ELISA方法证实阳性噬菌体和合成短肽能与p75NTR结合 ,并证实了它们对R2L1细胞去血清培养后的凋亡有抑制作用     

噬菌体展示重组人淋巴毒素突变体库及受体亲和筛选

淋巴毒素 (lymphotoxin , LT) 通过 TNFR1 受体传递凋亡信号,从而发挥抗肿瘤活性 . 对 LT 的受体结合区域进行多点随机突变,利用噬菌体展示重组人淋巴毒素 (rhLT) R46 , S106 , L130 三点随机突变组合文库和 S106 ～ F110 区域随机突变体库 . 噬菌体库与固相化 TNFR1 受体进行亲和筛选,富集了能与 TNFR1 受体结合的 rhLT 突变体 . 随机挑选 20 个单克隆噬菌体进行 ELISA 受体结合鉴定,其中 80 ％的克隆与 TNFR1 受体特异性结合,有 4 个克隆与 TNFR1 受体的结合能力高于野生型序列的 rhLT. 将这 4 个结合力高的突变体克隆于 pET32a(+) 载体,经过大肠杆菌表达和纯化操作后,检测这些突变体蛋白与 TNFR1 受体的结合活性和对 L929 细胞的杀伤活性,发现 3 个克隆的受体结合性质与其展示于噬菌体上时基本吻合,其中 C199 克隆与 TNFR1 的结合活性比野生型序列的 rhLT 提高了近 30 ％,且其对 L929 细胞的杀伤活性提高了近 90%. 应用噬菌体展示技术对淋巴毒素进行体外进化研究的尝试,为下一步的蛋白质结构和功能研究提供了思路,可成为大分子药物开发的有效工具 .     

蛋白质体外磷酸化方法的建立

蛋白质的磷酸化与去磷酸化调节方式在细胞信号传递过程中占有极其重要的位置. 建立鉴定蛋白质磷酸化的可靠方法具有重要意义. 毛细血管扩张性共济失调症突变蛋白(ataxia-telangiectasia mutated, ATM）是直接感受DNA双链断裂损伤,并起始诸多DNA损伤信号反应通路的主开关分子. 电离辐射（IR）细胞学反应中,ATM激酶可通过磷酸化活化p53蛋白,原核表达p53融合蛋白,免疫沉淀IR活化的野生型ATM蛋白,进行蛋白质的体外磷酸化反应. 实验验证了ATM对p53蛋白的磷酸化作用. 这一方法的建立可为研究细胞信号转导途径中蛋白激酶对底物的磷酸化作用及筛查激酶底物提供标准化的技术手段.     

利用噬菌体随机肽库筛选可结合志贺毒素B亚单位的短肽序列

以制备的重组志贺毒素B亚单位(StxB)为靶标,利用噬菌体展示亲和淘选技术,经4轮筛选,从随机十二肽库中筛选到与StxB结合的一批噬菌体克隆,对特异结合活性较高的27个噬菌体克隆的表面展示肽进行序列测定,其中A6序列出现16次,A9和A3序列分别出现2次和3次。为评价筛选克隆中和毒素毒性的能力,将展示肽出现频率最高的A6噬菌体克隆,体外与志贺毒素孵育进行动物试验,动物存活率达33.3%,表明毒素的毒性得到部分抑制,A6短肽可能发展成为志贺毒素的拮抗剂。     

利用噬菌体肽库筛选与HIV-1p24抗原结合的多肽

通过噬菌体展示技术筛选出与HIV-1p24抗原结合的多肽,为用多肽辅助p24抗原检测提供实验基础.以重组p24抗原为靶蛋白,对噬菌体随机七肽库进行三轮筛选,用EUSA鉴定第三轮筛选到的噬菌体克隆与p24重组抗原的结合能力,再对噬菌体克隆进行测序分析,同时研究了ELISA中噬菌体加入量及多种封闭剂对噬菌体特异性结合能力的...     

用噬菌体随机肽库筛选SARS冠状病毒S蛋白单克隆抗体2C5的模拟表位

SARS-CoVS蛋白特异的单克隆抗体2C5具有病毒中和作用。以单克隆抗体2C5为筛选靶分子,筛选噬菌体展示随机7肽库。经三轮淘洗后随机挑选20个噬菌体克隆进行ELISA分析和序列测定。在10个ELISAOD值大于0.2的阳性噬菌体克隆中,有8个噬菌体克隆展示有共同的7肽序列TPEQQFT。展示有该序列的噬菌体克隆能竞争抑制SARS-CoVS蛋白抗原与单抗2C5的结合。结果表明TPEQQFT为单克隆抗体2C5的模拟表位。该结果可对进一步研究S蛋白结构与功能和设计SARS疫苗有一定的参考意义。     

具有GCSF活性的噬菌体展示肽

从NFS 6 0细胞中克隆了小鼠粒细胞集落刺激因子 (granulocytecolony stimulatingfactor,G CSF)受体的细胞因子受体同源区 (cytokinereceptorhomologous ,CRH)结构域 ,采用GST融合表达策略 ,实现了CRH结构域的表达 .以纯化的GST CRH融合蛋白为靶 ,从噬菌体随机环七肽库中筛选CRH结构域的结合肽 ,找到两组具有核心序列的噬菌体展示肽 .其中C2和C13噬菌体展示肽能刺激NFS 6 0细胞增殖 ,说明C2和C13噬菌体展示肽具有G CSF活性     

噬菌体展示 protein A 及 protein L Ig 结合单结构域随机组合文库及 Ig 亲和筛选

Protein A 和 protein L 是细菌产生的两种结构和功能均不同的免疫球蛋白 (immunoglobulin , Ig) 结合分子,在细菌的致病中起重要作用 . 用含 SacⅠ位点的特定引物 PCR 分别扩增制备 protein A 的 A 、 B 、 C 、 D 抗体结合结构域和 protein L 的 B3 抗体结合结构域,各结构域 DNA 片段经 SacⅠ酶切后,再随机连接形成各种不同长度的分子组合文库,将该文库呈现在噬菌体表面构建了噬菌体展示 Ig 结合分子单结构域随机组合文库,所建组合文库容量为 2.3×10⁶个菌落形成单位,滴度为 4.1×10¹¹TU/ml , 包含各种单结构域片段,并以随机方式连接 . 用人 Ig 对该文库进行 4 轮亲和筛选,随机挑选 36 个代表性的阳性克隆进行序列测定分析表明,亲和筛选获得了多种非天然形式存在的新的 Ig 结合分子结构,其中 32 个克隆具有由 protein L 的单结构域和 protein A 的单结构域间隔重复排列而成的特征性 (MDPL-MDPA)n 结构 . 对噬菌体展示 Ig 结合分子单结构域随机组合文库的体外分子进化研究的尝试,为 Ig 结合分子的结构和功能研究提供了一新的途径,也为 Ig 结合分子的定向改造打下基础 .     

BAD与JNK协同调节UV诱导的细胞凋亡

JNK和BAD(bcl-2相关死亡启动子)都是参与细胞凋亡的重要调控蛋白. 然而,二者在功能上的联系及其在细胞凋亡中的相互作用尚未见报导. 本研究证明, BAD可作为JNK的磷酸化底物, 与JNK相互作用, 协同调节紫外线（UV）诱导的细胞凋亡. 蛋白质印迹检测PARP (聚ADP核糖聚合酶)裂解, 以及流式细胞术检测细胞凋亡结果揭示, UV诱导的MEF细胞凋亡依赖JNK的激酶活性. siRNA敲降BAD的蛋白表达,可增加MEF细胞对UV 诱导的细胞凋亡的敏感性. UV处理的野生型MEF细胞抽提液（含JNK激酶活性）可催化GST-BAD底物发生磷酸化修饰, 而UV未处理的细胞抽提液却不能. 结果提示, UV激活的JNK活性可催化BAD磷酸化|体外合成的持续活化的JNK与GST-BAD体外共孵育结合质谱分析证明, JNK 可催化BAD蛋白的Thr-201磷酸化. 提示BAD是JNK的底物. 此外,野生型和T201A突变的BAD质粒转染BAD-/-细胞结果显示, BAD的T201磷酸化可抑制JNK激酶活性及其底物c-Jun的磷酸化, 提示BAD磷酸化对JNK具有负反馈调节作用. 上述结果证明,BAD作为底物可被UV激活的JNK激酶磷酸化|磷酸化BAD反过来又可抑制JNK的激酶活性, 负性调节细胞凋亡. 综上所述, BAD与JNK能够相互影响, 协同调控UV诱导的细胞凋亡.     

T7噬菌体展示人肝癌cDNA文库筛选人CD8~+T淋巴细胞特异结合分子

目的:利用噬菌体表面展示技术从人肝癌T7 cDNA文库中筛选出能与人CD8~+T淋巴细胞特异结合的蛋白分子。方法:以人CD8~+T淋巴细胞为筛选靶标,对人肝癌T7 cDNA噬菌体肽库进行4轮"吸附-洗脱-扩增"生物淘选与富集,ELISA鉴定特异结合的噬菌体单克隆;对获得的阳性克隆裂解液进行PCR扩增及DNA测序,然后进行生物信息学分析,确定所编码的结合蛋白。结果:经过4轮筛选,结合人CD8~+T淋巴细胞的噬菌体克隆得到富集,通过测序与同源性比对分析获得17个特异性结合的多肽序列;生物信息学分析发现阳性噬菌体克隆的同源蛋白中,可能与肝癌免疫逃逸相关的分子有Unc-51样自噬活化激酶1(ULK1)、一般受体磷酸肌醇相关支架蛋白1(GRASP)、中间α球蛋白抑制因子H1(ITIH1)、富含亮氨酸重复8家族成员D(LRRC8D)和CD164等。结论:从人肝癌T7 cDNA噬菌体肽库中筛选获得了能与人CD8~+T淋巴细胞特异结合的分子,为阐明人肝癌发生发展过程中肿瘤免疫逃逸相关机制奠定了基础。     

用氨甲蝶呤偶联琼脂糖亲和吸附法从人肝脏cDNA噬菌体展示文库中筛选氨甲蝶呤相互作用蛋白

目的:利用氨甲蝶呤(MTX)偶联琼脂糖凝胶吸附法从人肝脏细胞cDNA噬菌体展示文库中筛选与MTX相互作用的蛋白.方法:以偶联于琼脂糖凝胶表面的MTX为配基,通过"结合-洗脱-扩增"过程筛选与MTX相互作用的噬菌体.利用PCR对筛选结果进行监测,对筛选得到的噬菌体PCR产物进行序列测定和基因同源性分析.结果:通过五轮亲和筛选富集到特异噬菌体克隆,再通过PCR获得cDNA插入片段.通过BLAST程序搜索GenBank,证明筛选到的片段与人PI-3K相关蛋白激酶SMG-1异构体1蛋白同源性达100%.结论:利用偶联MTX的琼脂糖凝胶作为筛选基质,从T7噬菌体展示cDNA文库中富集特异噬菌体是一种方便、高效的MTX相互作用靶蛋白筛选方法,可为探讨小分子药物的分子作用机制提供借鉴和参考.     

文山松毛虫质型多角体病毒S8片段cDNA克隆与原核表达

文山松毛虫质型多角体病毒(DpwCPV)S8片段被克隆和测序,该片段全长1332bp,编码390个氨基酸组成的分子量大约为43kDa的蛋白P44.根据本实验室测定出的马尾松毛虫质型多角体病毒(DpCPV)基因组全序列,设计引物,扩增出文山松毛虫质型多角体病毒S8部分片段,并亚克隆出p44基因序列,然后将p44基因序列cDNA克隆到表达载体pET-28a中,构建成表达质粒pET-S8,用IPTG诱导大肠杆菌BL21,经SDS-PAGE证明p44基因在大肠杆菌中获得成功表达,并对其编码蛋白序列进行了分析.     

脑膜炎大肠杆菌IbeA蛋白结合肽序列的亲和筛选*

应用噬菌体展示肽库技术,以重组的脑膜炎大肠杆菌致病蛋白IbeA作为靶分子,经过吸附-洗脱-扩增-再吸附的亲和筛选,随机挑选亲和力强的噬菌体克隆,进行ELISA、竞争抑制实验和序列测定。结果显示,经3轮淘选后,间接ELISA鉴定得到高亲和性结合IbeA蛋白的15个阳性克隆。竞争抑制实验结果表明,游离IbeA蛋白能竞争抑制噬菌体结合肽克隆与固相包被的IbeA蛋白的结合,其抑制作用随游离IbeA蛋白浓度的降低而减弱。测序结果得到5种阳性噬菌体克隆展示肽序列。上述结果提示以脑膜炎大肠杆菌IbeA蛋白为靶筛选所获得