重组人淋巴毒素随机点突变组合文库的构建

构建重组人淋巴毒素（rhLT）随机点突变组合文库以进行体外分子进化及结构和功能的研究。应用含随机核苷酸序列的引物,通过Overlap PCR的方法分别对rhLT 的46、106和130位氨基酸进行定点随机突变,获得各单点随机突变体库。通过基因操作将这三个单点随机突变体库拼接并克隆于Pmd_18T载体建立三点组合突变体文库,DNA测序鉴定突变位点的随机性和多样性,原核表达该变异体库,体外测定生物学活性。成功获得rhLT三点随机点突变组合文库,其转化克隆数达到1.5×10⁵,是多样性理论值的4.5倍。50个样品的序列分析显示各个位点的核苷酸和氨基酸序列的突变都呈随机性分布。对原核表达的30个样品进行生物学活性测定,结果70%(21个)的样品无活性、23.3%(7个)的样品活性低于rhLT、6.7%(2个)的样品活性高于rhLT。成功构建了rhLT随机点突变组合文库,该库不仅在一级结构上具有良好的随机性和多样性,而且具有生物学活性的多样性,为应用噬菌体展示等高通量筛选策略对淋巴毒素进行体外分子进化和结构与功能的深入研究打下了基础。     

蝴蝶翅脉标本的简易制做方法

蝴蝶翅脉分布有一定程序 ,不同蝶类有不同的脉序 ,因而脉序就成为鉴定蝶类的重要标志之一。蝴蝶翅面遍布鳞片 ,制作翅脉标本实际上就是去除这层鳞片。由于蝴蝶的翅膀较薄且很脆 ,用毛笔刷去鳞片的这种传统方法较慢 ,且成功率不高。经多次实践 ,摸索出了一种简单易行的制作方法。1　工具　宽于 5 cm的透明胶、扁平镊子、脱脂棉。2　制做步骤　 1 )根据蝶翅的大小撕下 1块透明胶 ,将透明胶固定在桌面上 ,且使带有粘性的一面朝上。 2 )用镊子小心取下 1片蝶翅 ,注意不能有破损。将蝶翅粘在透明胶上 ,并用手轻轻按下 ,使蝶翅平展地粘在透明胶上…     

噬菌体展示重组人淋巴毒素突变体库及受体亲和筛选

淋巴毒素 (lymphotoxin , LT) 通过 TNFR1 受体传递凋亡信号,从而发挥抗肿瘤活性 . 对 LT 的受体结合区域进行多点随机突变,利用噬菌体展示重组人淋巴毒素 (rhLT) R46 , S106 , L130 三点随机突变组合文库和 S106 ～ F110 区域随机突变体库 . 噬菌体库与固相化 TNFR1 受体进行亲和筛选,富集了能与 TNFR1 受体结合的 rhLT 突变体 . 随机挑选 20 个单克隆噬菌体进行 ELISA 受体结合鉴定,其中 80 ％的克隆与 TNFR1 受体特异性结合,有 4 个克隆与 TNFR1 受体的结合能力高于野生型序列的 rhLT. 将这 4 个结合力高的突变体克隆于 pET32a(+) 载体,经过大肠杆菌表达和纯化操作后,检测这些突变体蛋白与 TNFR1 受体的结合活性和对 L929 细胞的杀伤活性,发现 3 个克隆的受体结合性质与其展示于噬菌体上时基本吻合,其中 C199 克隆与 TNFR1 的结合活性比野生型序列的 rhLT 提高了近 30 ％,且其对 L929 细胞的杀伤活性提高了近 90%. 应用噬菌体展示技术对淋巴毒素进行体外进化研究的尝试,为下一步的蛋白质结构和功能研究提供了思路,可成为大分子药物开发的有效工具 .     

脊髓背角浅层Hes5+星形胶质细胞在机械痛敏中发挥“门控”作用

近年来,人们对星形胶质细胞的功能有了更多更深入的认识。2020年11月,日本九州大学Makoto Tsuda教授实验室发表了题为脊髓背角浅层星形胶质细胞在机械痛敏中发挥"门控"作用的研究论文,揭示星形胶质细胞在机械痛传递过程中发挥关键作用(Nat Neurosci,2020,23:1376~1387)。     

长期有氧运动对中老年人甲襞微循环的影响

目的：观察中老年人甲襞微循环的变化,探讨长期有氧运动对中老年人甲襞微循环的影响。方法：根据试验要求招募21名受试者,男女比例2：1,年龄53.23 ±8.12岁,对其进行两个阶段的有氧运动干预。第一阶段：以50%最大摄氧量运动8周。具体运动方式为慢跑（跑步机或室外）,每周运动4次,每次运动1 h。第二阶段：以65%~70%最大摄氧量运动6周,运动方式同第一阶段。分别在运动开始前、第一阶段运动结束后和第二阶段运动结束后使用XTL-1型微循环显微镜对受试者左手无名指的甲襞微循环进行测试。结果：①第一阶段结束后受试者管袢形态积分值和总积分值与试验前相比显著性下降（P < 0.05）,第二阶段结束后管袢形态积分（P < 0.01）、血流形态积分（P < 0.05）、袢周形态积分（P < 0.05）及总积分值（P < 0.05）与试验前相比都明显降低。（2）部分子指标：第一阶段结束后乳头积分值与试验前相比明显下降（P < 0.05）;第二阶段结束后流速积分值（P < 0.05）、管袢畸形积分值（P < 0.05）、清晰度积分值（P < 0.05）、乳头积分值（P < 0.01）与试验前相比显著下降。结论：长期的有氧运动可使中老年人甲襞微循环的形态结构和生理功能得到一定程度的改善。在一定强度的范围内,运动强度越大中老年人微循环系统改善的程度越高,建议中老年人在进行体育锻炼时运动强度应不低于50%最大摄氧量。     

共情让大鼠减少“损人利己”的行为

同理心或共情(empathy)是一种分享他人感受的能力。从上世纪60年代开始,人们开始通过动物实验对共情的产生机制及其特征进行研究。但在这些实验中,受害者(victim)所接受的伤害性刺激均依赖于实验者外在施加。2020年3月,荷兰阿姆斯特丹大学Christian Keysers实验室发表文章报道(Curr Biol,2020,30949~961.e7),他们建立了一种大鼠通过主动压杆获取奖赏刺激,同时引发对同伴伤害性刺激的行为学测试模型。在此模型基础上,作者探讨了共情行为的特性及相关脑机制。     

用反向斑点杂交方法检测猪常见致病菌

目的:建立检测猪常见致病菌的反向斑点杂交方法。方法:将23S rRNA基因芯片用的针对12种细菌的25～30 mer探针加长到30～38 mer,2对通用引物序列不变。用地高辛标记下游引物,以尼龙膜为载体制备膜芯片,检验探针/膜杂交的特异性和敏感性;另外设计1条大肠杆菌K88基因探针、一段带K88探针的报告基因和1对报告基因的反向PCR引物,在PCR体系中增加封口的K88报告基因和反向引物对,被检样品扩增后进行膜杂交。结果:修改的13条探针与参考目标菌株在膜上成特异性杂交,对52个参考菌株和野外分离株的检测准确率为92%;膜杂交的敏感性与玻片芯片接近,最小检出量为100 fg DNA;在尼龙膜上增加K88探针,与3重PCR产物杂交,可以检测到大肠杆菌K88毒力基因。结论:建立的反向斑点杂交方法简便快速,检测成本低,可用于仪器设备不足的实验室,同时可以加入检测如大肠杆菌K88等致病基因,提高基于保守基因的芯片的诊断能力。