膜色谱技术及其在生化快速分离分析中的应用

生物技术为人类提供越来越多的具有特殊疗效的生化药品,如干扰素、白细胞介素、细胞集落刺激因子等等。在科研及生产过程中,存在着大量的蛋白质、多肽和核酸等生物大分子的分析、分离和纯化工作,迫切需要高效、快速的分析、分离和制备方法,特别是用于临床的生化药品,不仅要达到很高的纯度,而且还要在分离过程中最大限度地保持其生物活性。据统计,生物工程产品的分离纯化成本占其全部成本的６０－８０％。国外在这方面正...     

基于环氧功能基团的杂化硅胶固定化酶反应器

在蛋白质组学研究中, 为解决自由溶液酶解时间长、蛋白酶自降解等问题, 各种类型的固定化酶反应器引起了人们的关注. 采用溶胶凝胶法, 在100 µm内径毛细管内, 以3-(甲基丙烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷为功能单体, 以四乙氧基硅烷为交联剂, 制备了一种新型的杂化硅胶整体材料. 并通过在整体柱表面由环氧功能团水解得到的二醇与胰蛋白酶(trypsin)的氨基进行一步反应, 实现了胰蛋白酶固定化. 利用该IMER, 在47 s内实现了牛血清白蛋白的酶解; 经反相色谱分离和质谱鉴定, 序列覆盖率在35%以上, 与自由溶液酶解12 h的效果相当. 结果表明, 基于亲水性杂化硅胶整体材料的IMER有望在蛋白质组学研究中发挥重要作用.     

基体辅助激光解吸电离质谱法及其应用

基体辅助激光解吸电离质谱是近几年才发展起来的一种新技术,它在生命科学研究中具有广阔的应用前景．对基体辅助激光解吸电离质谱技术的基本原理,运用基体辅助激光解吸电离质谱法研究蛋白质分子量的测定,蛋白质混合物的分离鉴定以及用基体辅助激光解吸电离质谱技术进行超快速的蛋白质序列分析和DNA序列分析的可行性和存在的问题作了介绍和讨论．     

用氨甲蝶呤偶联琼脂糖亲和吸附法从人肝脏cDNA噬菌体展示文库中筛选氨甲蝶呤相互作用蛋白

目的:利用氨甲蝶呤(MTX)偶联琼脂糖凝胶吸附法从人肝脏细胞cDNA噬菌体展示文库中筛选与MTX相互作用的蛋白.方法:以偶联于琼脂糖凝胶表面的MTX为配基,通过"结合-洗脱-扩增"过程筛选与MTX相互作用的噬菌体.利用PCR对筛选结果进行监测,对筛选得到的噬菌体PCR产物进行序列测定和基因同源性分析.结果:通过五轮亲和筛选富集到特异噬菌体克隆,再通过PCR获得cDNA插入片段.通过BLAST程序搜索GenBank,证明筛选到的片段与人PI-3K相关蛋白激酶SMG-1异构体1蛋白同源性达100%.结论:利用偶联MTX的琼脂糖凝胶作为筛选基质,从T7噬菌体展示cDNA文库中富集特异噬菌体是一种方便、高效的MTX相互作用靶蛋白筛选方法,可为探讨小分子药物的分子作用机制提供借鉴和参考.     

用昆虫细胞表达系统表达人组织激肽释放酶原

目的:利用杆状病毒-昆虫细胞表达系统表达proHUK,系统优化表达条件。方法:用改进的方法对昆虫细胞进行了无血清悬浮适应培养,用ELISA、SDS-PAGE方法对各种条件下proHUK的表达量进行检测。结果:Sf-9、Hi-5细胞在血清减量速度为5%、1%,接种密度分别为2×106cells/mL1、×106cells/mL时能很快适应无血清悬浮培养。在病毒感染复度MOI为10,细胞接种密度为1×106cells/mL条件下培养96h后,proHUK的表达量最高可达30mg/L。结论:改进的方法使昆虫细胞能更快适应无血清悬浮生长条件,获得了高表达proHUK的方法,为其大规模制备奠定了基础。     

高效亲和膜色谱快速分析及小量制备蛋白质

以甲基丙烯酸缩水甘油酯纤维素复合膜为基质,分别以蛋白A(Protein A)、人免疫球蛋白G(HIgG)、三嗪染料(Cibacron blue F3GA)、亚胺二乙酸铜离子为配基,用不同方法制备了适合于分析及小量制备的高效亲和膜色谱介质,并对高效亲和柱的基本性能及其应用于各种相应蛋白的定量测定情况进行了考察。利用这种方法可以针对不同的目标蛋白及所存在的环境采用不同的配基,对各种蛋白的定量测定及小量制备可达到较为满意的结果。     

壳寡糖诱导的烟草SKP1基因表达

壳寡糖是一种高效的植物抗性诱导剂,应用mRNA差异显示技术从经过壳寡糖诱导的枯斑三生烟草叶片中分离到了编号为5、31、37和46的4个基因片段.4个基因片段与本塞姆氏烟草(Nicotiana benthamiana)SKP1基因的mRNA同源性都达到82%,据此推断这4个片段是感病烟草品种枯斑三生烟草的SKP1基因.质粒双酶切及反向Northern分析结果表明,该基因表达在壳寡糖诱导下增强.由于SKP1基因与植物的抗病毒病相关,从而在mRNA水平上验证了壳寡糖的诱导抗性效应.     

溴化1-丁基,3-(3-氨丙基)咪唑用于羧基衍生:潜在应用于肽段的高灵敏度质谱鉴定

本文发展了阳离子衍生化试剂溴化1-丁基,3-(3-氨丙基)咪唑(BAPI),并应用于肽段的羧基衍生化.以合成肽段RVYVHPI(RI-7)作为样品,其衍生化标记效率可接近100%.此外,肽段衍生物在含0.1%的三氟乙酸水溶液或乙腈/水(体积比1︰1)溶液中至少可稳定保存1周.进一步研究了BAPI衍生对肽段离子化效率的影响.结合基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)分析,模式肽段RI-7的检测灵敏度可提高42倍以上,优于商品化哌嗪试剂的衍生效果.此外,衍生肽段在电喷雾质谱(ESI MS)中的离子带电荷数也得到显著提高.上述结果表明,BAPI是一种具有潜在优势的衍生化试剂,有望应用于肽段的高灵敏度质谱鉴定研究.     

蛋白质组研究中分离新技术与新方法

对于蛋白质组的研究离不开分析技术的支撑。由于样品及其基质的复杂性,为了实现蛋白质的高通量、高灵敏度、快速分析鉴定,必须发展与之匹配的新技术与新方法。多维高效液相色谱/毛细管电泳技术,部分弥补了传统2D PAGE的不足,近年来,在蛋白质分离鉴定方面取得了最令人瞩目的成绩。本文分别从多维液相色谱分离技术、多维毛细管电泳蛋白质分离平台、微柱液相-毛细管电泳联用技术、极端pH蛋白质的分离分析和蛋白质的在线富集技术等方面对蛋白质组学研究中在新技术与新方法方面近期取得的成果加以系统阐述。