β淀粉样肽单克隆抗体可变区基因的5′RACE扩增及序列分析

目的:克隆并分析抗β淀粉样肽单克隆抗体轻链与重链可变区基因。方法:从分泌抗β淀粉样肽单克隆抗体的杂交瘤细胞株A8中提取总RNA,根据恒定区序列设计基因特异性引物,通过5′RACE法扩增抗体的轻链和重链可变区基因,测定并分析可变区基因序列,并克隆入pMD18-T载体。结果:重链可变区基因序列全长450bp,编码150个氨基酸残基;轻链可变区基因序列全长429bp,编码143个氨基酸残基。在GeneBank中对氨基酸序列进行比对分析,二者均符合小鼠IgG可变区基因的特征。根据Kabat法则对A8抗体轻链和重链可变区氨基酸序列基因进行分析并确定了3个抗原互补决定区(CDR)、4个框架区(FR)和信号肽。结论:通过5′RACE法得到了抗β淀粉样肽单克隆抗体轻链与重链可变区基因,为进一步研究抗体三维结构,以及对该抗体进行人源化改造奠定了基础。     

甲型H1N1流感病毒血凝素单克隆抗体轻链和重链可变区基因的巢式PCR扩增及序列分析

目的：采用巢式PCR对甲型H1N1流感病毒血凝素单克隆抗体的轻链和重链基因进行扩增,对获得的基因进行序列分析,并找出克隆鼠Igκ轻链和重链可变区基因的通用方法。方法：设计22对扩增鼠Igκ轻链可变区和重链可变区基因的引物,对6株鼠抗人甲型H1N1流感病毒血凝素单克隆抗体的轻链和重链可变区基因进行克隆并测序,与NCBI公布的鼠免疫球蛋白序列比对分析。结果：巢式PCR方法可以有效避免单克隆抗体克隆过程的假基因,并且得到的单克隆抗体的氨基酸序列均符合鼠免疫球蛋白可变区特征。结论：建立了克隆鼠免疫球蛋白轻链和重链可变区基因的通用方法,为后期克隆鼠源性单克隆抗体的可变区基因提供了基础,并为研究甲型H1N1流感病毒血凝素与抗体的结合位点提供了实验数据。     

人源抗肿瘤坏死因子—α噬菌体抗体的基因结构分析

从混合的噬菌体抗体库中筛选到了抗人ＴＮＦα的人源单克隆抗体,并对筛选到的抗体基因进行了序列测定和分析。结果表明,筛选到的４个特异性抗ＴＮＦα噬菌体抗体克隆的重链的重链基因序列相同,该重链基因长６８１ｂｐ,编码２２７个氨基酸残基,属于人免疫球蛋白第Ⅲ家族,其中１－１１９位氨基酸残基为重链可变区（ＶＨ）,１２０－２２７位为重链恒定区１（ＣＨ１）。４个噬菌体抗体克隆的轻链均缺失,因此实际上筛选到的是单重     

抗HFRSV人单抗可变区基因克隆及其序列测定

从杂交瘤细胞株87—2提取细胞总RNA．反转录合成cDNA链,进行PCR反应。其中扩增重链可变区一对引物分别与人免疫球蛋白重链v区基因5＇端和J区基因3＇端互补;扩增人λ轻链可变区引物与人免疫球蛋白λ轻链v区基因5＇端和J区基因3＇端互补。将重、轻链可变区基因的PCR扩增产物分别插入M13噬菌体．经转化筛选分别获得重组克隆。双脱氧法测定其序列,所得核苷酸序列经计算机分析,轻、重链可变区基因长度分别为309bp和405pb,编码103个氨基酸和135个氨基酸,有明显抗体可变区特征,具有骨架区和抗原互补区。     

抗人CD3单抗重、轻链可变区基因的体外扩增、克隆和序列分析

根据免疫球蛋白重链和轻链可变区基因５’端序列和Ｊ区序列,化学合成适合于体外扩增抗体重、轻链可变区基因的二对引物。从体外培养的ＯＫＴ３杂交瘤细胞中提取总ＲＮＡ,反转录生成ｃＤＮＡ,以ｃＤＮＡ为模板,分别加入合成的重、轻链可变区引物进行ＰＣＲ,扩增出抗体重、轻链可变区基因片段。将扩增产物分别插入ｐＵＣ１９质粒,筛选出阳性克隆,用链终止法进行ＤＮＡ序列测定。所测重链可变区基因全长３５７ｂｐ,编码１１９个氨基酸,轻链可变区基因全长３２１ｂｐ,编码１０７个氨基酸。     

抗人血管内皮生长因子单链抗体基因的构建、表达及活性鉴定

鼠单克隆抗体E11能与人血管内皮生长因子(VEGF)特异结合,已用于临床检测恶性肿瘤细胞VEGF的表达,并初步证明其体内抑瘤活性。为便于大规模生产,特进行基因工程改造,构建小分子的单链抗体(scFv)。首先通过逆转录及多聚酶链式反应(PCR),分离并克隆E11的可变区基因。经测序表明,E11轻链可变区(VL)基因全长333bp,编码111个氨基酸,归属小鼠轻链可变区基因第Ⅲ亚组。重链可变区VH基因全长369bp,编码123个氨基酸,归属小鼠重链可变区基因Ⅱ(A)亚组。然后用一编码亲水性多肽接头的DNA片断将E11单抗轻、重链可变区基因连接,构建表达质粒pET-15YV,在大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达。表达产物(包含体)经变性及复性后,用免疫组化法检测该单链抗体结合抗原(颊癌)能力。对颊癌组织检测的结果表明,基因工程抗体scFv与亲代抗体一样,具有较高的组织特异性。本研究获得的抗人VEGF单链抗体具有潜在的临床价值,为肿瘤放射免疫显像及以血管为靶标的抗血管生成治疗奠定了基础。     

A型肉毒毒素表位多肽免疫和人源噬茵体单链抗体文库的构建

采用表位合成多肽免疫获得编码人源抗体的基因材料,抗体轻重链可变区基因通过剪接重叠延伸(SOE)技术进行组装后,亚克隆入噬菌体粒中构建免疫库。以重组制备的A型肉毒毒素保护性抗原为配体筛选结合子,ELISA鉴定,获得具有较高抗原结合力的噬菌体克隆,进行基因测序和家族定位分析。结果显示,表位合成多肽免疫,成功构建了库容大于10^8的重组抗体库。体外3轮免疫淘筛,筛选到人源A型肉毒抗毒素克隆,基因结构分析表明,其中ScFvB17全长750bp,可编码250个氨基酸残基：VH属于VH4家族,369bp,编码123个氨基酸残基;Vκ属于κ链Ⅱ家族,336bp,编码112个氨基酸残基。基因的同源分析表明,这是一株特异的单链抗体新基因。     

入源中和性抗甲型肝炎病毒抗体Fab段基因的序列分析及可溶性表达

在用噬菌体表面呈现系统获得人源抗甲型肝炎(甲肝)病毒中和性基因工程Fab抗体的基础上,对所获得的4株中和性Fab抗体轻重链可变区基因进行了序列分析、可溶性表达及生物学特性鉴定.4株Fab抗体重链可变区拥有99%同源的核苷酸序列和相同的CDR区氨基酸序列,属于VHⅢ基因家族.而轻链可变区核苷酸序列同源性为95%和相似的CDR区氨基酸序列,属于VL5基因家族.这些重组抗体都能与人甲肝恢复期血清及具有中和活性的鼠抗甲肝单克隆抗体产生竞争抑制反应,表明其针对甲肝病毒结构蛋白上的主要抗原决定簇.     

紫杆柽柳与其它物种脂质转运蛋白基因编码蛋白的同源性比较

根据从柽柳cDNA文库克隆获得的脂质转运蛋白(LTP)的部分序列,用RACE技术克隆出其全长cDNA序列.基因的5'非翻译区96bp,3'非翻译区222bp,开放阅读框285bp,编码94个氨基酸,预计蛋白的分子量为9.9 kD,等电点为8.02.此基因有8个位置保守的Cys残基及26个氨基酸的信号肽,为典型的植物脂质转运蛋白基因.其基因序列数据库(GenBank)登录号为AY574218(基因)和AAS79106(蛋白).     

锌螯合物抗体可变区的克隆鉴定、真核表达及重组抗体的三维模建

筛选得到能分泌抗锌(Ⅱ)-二乙烯三胺五乙酸( Zn(H)-DTPA)的单克隆抗体杂交瘤细胞株2E8E3.经测定,此株细胞分泌IgM,轻链K型抗体.为了得到该抗体可变区序列,分别在小鼠抗体的信号肽区域和抗体的第一恒定区半胱氨酸残基(Cys)附近选择合适引物,通过RT-PCR方法,得到重(VH)、轻(V1)链可变区序列.将序列进行BLAST分析、SignalP分析、IMGT-V/QUEST分析,结果显示,克隆到的VH-2E8E3( 465 bp)和VL-2E8E3( 417 bp),序列与小鼠μ重链,κ轻链抗体可变区序列具有同源性(相似度＞97％),前端序列符合信号肽特征,抗体骨架区( Framework region,FR)及第一恒定区均含有保守半胱氨酸(Cys)残基.在此基础上,构建了重组抗体的真核表达载体,转染293T细胞并用间接ELISA法初步验证其具有表达活性.对重组抗体进行了三维模拟,并推测了主要氨基酸残基.试验结果表明,克隆到了正确的2E8E3抗体可变区序列并初步鉴定为有活性.     

抗人CD3单抗重,轻链可变区基因的体外扩增,克隆和序列分析

根据免疫球蛋白重链和轻链可变区基因５＇端序列和Ｊ区序列,化学合成适合于体外扩增抗体重、轻链可变区基因的二对引物。从体外培养的ＯＫＴ３杂交瘤细胞中提取总ＲＮＡ,反转录生成ｃＤＮＡ,以ｃＤＮＡ为模板,分别加入合成的重、轻链可变区引物进行ＰＣＲ,扩增出抗体重、轻链可变区基因片段。将扩增产物分别插入ｐＵＣ１９质粒,筛选出阳性克隆,用链终止法进行ＤＮＡ序列测定。所测重链可变区基因全长３５７ｂｐ,编码１１９个     

鼠抗HFRSV衣壳蛋白McAb F3株可变区基因的获取及特性分析

培养鼠抗肾综合征出血热病毒衣壳蛋白Ｆ３杂交瘤细胞株,提取总ＲＮＡ,根据鼠源ＩｇＧ抗体基因家族可变区基因碱基序列的特点,设计简并引物,通过逆转录聚合酶链反应,获得抗体轻链可变区和重链可变区基因。分别将其克隆入载体ＰＴ７ＢｌｕｅＴ Ｖｅｃｔｏｒ,选取阳性重组克隆各两个,分别测定了所载重链可变区和轻链可变区基因的碱基序列,比较了不同克隆轻链可变区基因之间和重链可变区基因之间碱基序列的差异;分析了各自的氨基酸框架及其对应蛋白的亲水性。结果显示,两个重链可变区基因碱基序列有４处不同,同源性为９７９％;其中重组克隆ＺＧ３６４ ５Ｆ所载重链可变区基因有完整的开放阅读框架,对应的蛋白含有丰富的亲水基因,第１１２氨基酸处亲水性最高;另一重组克隆ＺＧ３６４ ４Ｆ所载重链可变区基因不能通读。两个轻链基因碱基序列有４处不同,同源性为９９１％,重组克隆ＺＧ３６５ ５Ｆ和ＺＧ３６５ ７Ｆ所载轻链可变区基因均有完整的开放阅读框架,对应的蛋白均含有丰富的亲水基因,ＺＧ３６５ ５Ｆ所载基因对应蛋白第６７氨基酸亲水性最高,ＺＧ３６５ ７Ｆ所载基因对应蛋白第３４氨基酸亲水性最高。     

抗人CD8单抗κ轻链可变区基因的克隆和序列测定

OK T8杂交瘤细胞株从American typecuhure collection(ATCC)获得,产生抗人CD8分子的单克隆抗体IgG2a(γ2a,κ),为了对这一鼠源性单抗进行基因工程改造,我们首先克隆了该单抗的κ轻链可变区基因,并测定了其碱基序列,现将结果报道如下: 通过计算机查找并分析了已发表的几十株抗体的轻链可变区基因序列,经比较其5’端保守序列和J区序列,设计了一对DNA引物:GTGAATTCATGGACATCCAGATGACCCA-     

抗炭疽保护性抗原单克隆抗体可变区基因的克隆及序列分析

目的:克隆并分析抗重组炭疽芽孢杆菌保护性抗原(rPA)单克隆抗体4B2、5E1和2A8轻、重链可变区基因。方法:从分泌抗rPA特异性单抗的杂交瘤细胞株4B2、5E1和2A8中提取总RNA;利用RT-PCR技术克隆抗rPA单抗4B2、5E1和2A8的VL、VH基因,并将其连入pMD18-T载体中进行测序分析。结果:4B2VL基因全长378bp,VH基因全长414bp;5E1VL基因全长420bp,VH基因全长426bp;2A8VL基因全长384bp,VH基因全长342bp。通过分析,这些基因均符合小鼠IgGV区基因的特征,含有4个框架区、3个抗原互补决定区,而且抗体特征性的半胱氨酸残基的数量和位置也正确。结论:克隆了抗rPA单抗4B2、5E1和2A8的VL、VH基因,为下一步构建多种形式的基因工程抗体奠定了良好的基础。     

免疫球蛋白变区基因的体外扩增及人－鼠嵌合抗体的表达

应用聚合酶链反应法体外扩增抗人小细胞肺癌单克隆抗体的变区基因,经核苷酸序列分析,轻链变区基因为３２４ｂｐ,编码１０８个氨基酸;重链变区基因为３５１ｂｐ,编码１１７个氨基酸。将重链变区基因克隆至ｐＳＶ_２△ＨｇｐｔＨｕγ_３质粒,经一系列克隆、筛选,得一插入方向正确的表达人－鼠嵌合重链抗体的载体－ｐＳＶ_２△Ｈｇｐｔ２Ｆ７ＶＨＨｕγ_３。用电穿孔方法将该质粒导入鼠源骨髓瘤细胞Ｊ５５８Ｌ,用霉酚酸进行初步筛选,最终用兔抗人免疫球蛋白ＩｇＧＦｃ片段的抗体筛选得七株阳性克隆,免疫印迹法结果表明在与人ＩｇＧ相同位置上有一阳性条带。     

应用RACE法克隆鸽恒定链基因的研究

为比较禽类恒定链的结构和功能, 应用RACE (Rapid Amplification of cDNA Ends) 技术首次克隆并鉴定了鸽恒定链基因。首先用一对含高度保守的DNA片段的简并引物, 从鸽脾细胞RNA扩增部分恒定链片段, 接着测序并设计新引物分别从5′和3′RACE扩增延长该片段。最后根据全基因的序列设计上、下游引物,获得大小为1 050 bp的全长cDNA。比较核苷酸序列, 鸽与鸡的Ii链同源性达到82.8％, 而与人等其它动物的同源性则在52.0％以上; 其中633 bp的开放阅读框编码211个氨基酸残基的前体蛋白。推导和分析氨基酸序列表明, 分子结构与鸡恒定链相似, 其中有些氨基酸残基表现出较高的保守性。     

抗人AEG-1单克隆抗体可变区基因克隆及序列分析

AEG-1基因位于人染色体8q22,编码582个氨基酸,参与多种信号转导途径并与多种恶性肿瘤的发生、发展及生物学表型密切相关。为更好地探讨AEG-1生物学功能,以纯化的pGSTag-AEG-1蛋白免疫BALB/c小鼠,应用细胞融合技术并经筛选及鉴定,获得了分泌抗人AEG-1单克隆抗体的杂交瘤细胞株1E3;Western blot及免疫组化证实该细胞株分泌的单克隆抗体能与肿瘤细胞中AEG-1蛋白特异性结合;RT-PCR方法从1E3细胞中克隆出抗AEG-1抗体的VH和VL基因片段,通过测序分析、碱基和蛋白序列的比对确认该株抗体为鼠源性IgG的轻、重链可变区基因。进一步运用Kabat System在线分析系统对VH和VL基因进行结构分析,确证FWRs和CDRs的结构完整,VH编码117个氨基酸;VL编码119个氨基酸,属于轻链κV家族。实验结果为进一步研究AEG-1与恶性肿瘤发生、发展的关系及在其临床诊断中的应用奠定了基础。     

抗人黑色素瘤单链抗体基因在大肠杆菌中的融合表达

应用RT-PCR技术从分泌抗人黑色素瘤单克隆抗体的杂交瘤细胞HB8760中克隆了抗体轻、重链可变区基因,用(Gly₄Ser)₃连接肽基因将V_H、V_L连接成ScFv基因,并进行了序列测定。ScFv基因全长927bp,其中VH基因长360bp,编码120个氨基酸,V_L基因长324bp,编码108个氨基酸。在大肠杆菌融合表达载体pGEX-4T-1中表达了GST-ScFv融合蛋白,表达产量占菌体总蛋白的29%。凝血酶消化后的产物具有黑色素瘤细胞结合活性。     

抗甜菜坏死黄脉病毒单链抗体表达载体的构建及其表达

用ＰＣＲ方法以分泌抗甜菜坏死黄脉病毒（ＢＮＹＶＶ）单克隆抗体的杂交瘤细胞的基因组为模板,扩增了编码ＢＮＹＶＶ单抗的重链可变区（ＶＨ）基因。测序表明,该ＶＨ序列属于小鼠ＩＩ（Ａ）亚类,全长为３６０ｂｐ,编码１２０个氨基酸。将其和先前克隆的轻链基因分别插入到一个含有连接ＶＨ和ＶＬ基因的连接序列的质粒之中,构建成单链抗体（ｓｃＦｖ）基因的表达载体ｐＴＣｓｃＦｖ。将质粒在大肠杆菌中表达,ＥＬＩＳＡ法检测出     

小鼠TIM1,TIM2和TIM3基因的克隆与序列分析

目的：克隆小鼠TIM1、TIM2及TIM3基因全长编码区cDNA,同时对其进行序列分析.方法：采用RT-PCR方法,从小鼠活化淋巴细胞中获取TIM1、TIM2及TIM3基因cDNA全长,克隆至pMD18-T载体,选择阳性克隆进行序列测定.结果：扩增得到小鼠TIM1、TIM2及TIM3基因编码区cDNA全长分别是918bp、918bp和846bp,分别编码306、306和282个氨基酸残基,与GeneBank中发表的序列完全一致.结论：获得小鼠TIM1、TM2及TIM3基因的全长克隆,为进一步研究其生物学功能奠定了基础.