电子鼻技术在快速检测小麦矮腥黑穗病菌中的应用

由小麦矮腥黑穗病菌(TCK)引起的小麦矮腥黑穗病是我国重要的检疫性病害,为明确电子鼻技术在快速检测小麦矮腥黑穗病菌方面的可行性,利用电子鼻对含有TCK和小麦光腥黑穗病菌(TFL)不同冬孢子数(50g小麦种子中冬孢子数分别为0、100、101、102、103、104、105)的小麦进行了检测,采用主成分分析法(PCA)和线性判别法(LDA)进行数据分析。结果发现,这2种分析方法均可将不含TCK冬孢子的小麦和含TCK冬孢子的小麦区分开来,而且通过LDA分析,可将TCK冬孢子含量为100、101、102及103以上的处理区分开来。另外,通过PCA分析,可将TCK与TFL区分开来。此结果为电子鼻技术在快速检测小麦矮腥黑穗病菌中的应用奠定了基础。     

小麦矮腥黑穗菌差异片段筛选与分子检测体系的建立

采取随机扩增DNA多态性(Random amplified polymorphic DNA,RAPD)引物介导的半特异PCR技术(RAPD primer mediated hemi-specific PCR,RM-PCR),在从不同地域征集的18个小麦矮腥黑穗菌(Tilletia controversa Kühn,TCK)菌株和29个小麦网腥黑穗病菌(Tilletia caries(DC)Tul,TCT)菌株的总基因组DNA中筛选鉴定出TCK独有的大小为1322bp差异基因组片段。根据该片段序列设计筛选出2对特异性引物CQUTCK2/CQUTCK3和CQUTCK4/CQUTCK5,均可以从18个TCK菌株的菌丝体和冬孢子DNA中稳定地扩增出747bp和200bp的单一靶带DNA,而在29个TCT菌株的菌丝体或冬孢子DNA均无任何扩增产物。以腥黑穗菌属通用引物对CQUK6/CQUK7为内置对照,可以确定被检样品是否含PCR抑制物质进而判断检测体系是否正确,同时有效地排除样品检测结果的假阳性和假阴性。采用建立的TCK特异PCR检测技术体系,实现简单而快速地鉴定小麦矮腥黑穗菌冬孢子或罹病小麦组织中侵染菌丝体的目的。     

雀麦上雀麦腥黑粉菌Tilletia bromi的分子检测

雀麦是重要的牧草,近年来进口量激增。寄生于雀麦上的腥黑粉菌共有4种,即小麦矮腥黑穗菌Tilletia controversa(TCK)、雀麦腥黑粉菌T.bromi、T.bolayi和小麦网腥黑穗菌T.caries(TCT),根据冬孢子形态难以直接区分这些种类。本文在形态、自发荧光和萌发生理三方面的比较研究基础上,依据beta-微管蛋白tub2基因序列设计一套引物,转化为特异SCAR分子标记,建立了雀麦上T.bromi的菌丝基因组DNA的特异PCR检测方法和冬孢子的套式特异PCR检测方法,为病害提供了快速、可靠的检测方法。     

小麦内源特异参照基因的查找与定性PCR和实时荧光PCR验证

目的:先从理论上查找和比对了小麦属(Triticum)γ-醇溶蛋白基因(GAG56D)为小麦特异的内源基因,并用定性PCR和实时荧光PCR方法从实验特异性上进行了验证。方法:选择小麦基因组中部分基因序列在NCBI中进行同源性分析,查找在小麦中存在的内源特异参照基因,找到小麦属(Triticum)特异的γ-醇溶蛋白基因(GAG56D),设计并合成该基因的引物和探针序列,同时用定性PCR和实时荧光PCR方法进行检测,并优化了实验条件。结果:不仅在理论上查找和比对了γ-醇溶蛋白基因为小麦特异的内源基因,并用定性PCR和实时荧光PCR方法进行了实验特异性的验证。定性PCR产物经过琼脂糖凝胶电泳分析后,只在小麦属中可以检测到328bp的目的片段,而在其它作物中未扩增出目的片断。同样实时荧光PCR验证的结果小麦属内各个种均有扩增曲线出现,而在其它作物没有扩增曲线出现中。结论:该基因与方法可用作检测小麦属(唯一小麦种是栽培作物)内源特异参照基因。     

小麦印度腥黑穗病菌和黑麦草腥黑粉菌检测标准分子构建

以小麦印度腥黑穗病菌和黑麦草腥黑粉菌为研究对象,采用分子克隆技术,分别构建了该两种真菌分子检测的标准分子。前者包括线粒体2297 bp的DNA序列以及rDNA710 bp的ITS序列,后者包括线粒体2.3kb的DNA序列以及rDNA710 bp的ITS序列。分别对该两个标准分子进行了性能评估试验,测试结果显示所构建的标准分子具有良好的特异性、均匀性和稳定性,能够满足小麦印度腥黑穗病菌和黑麦草腥黑粉菌分子检测需求。     

卡他莫拉菌实时荧光PCR检测方法的建立

[目的]建立基于SYBR GreenⅠ染料法的卡他莫拉菌实时荧光PCR检测方法。[方法]选取卡他莫拉菌两个的基因(uspA1和copB)设计特异性引物;提取卡他莫拉菌、嗜肺军团菌等11种呼吸道病原体的DNA,通过常规PCR和实时荧光PCR对引物的特异性进行验证;以卡他莫拉菌DNA为模板进行实时荧光PCR,获取扩增曲线、标准曲线、熔解曲线和熔解峰图,并判断检测方法的灵敏度;进行重复性试验,评估检测方法的组内和组间重复性;通过模拟临床样本,对检测方法的灵敏度进行验证。[结果]共设计出3对引物,对嗜肺军团菌等10种呼吸道病原体具有特异性;对卡他莫拉菌的最低检出浓度为1.0×10^(3)cfu/mL;组内和组间最大变异系数分别为1.78%、1.89%;模拟的临床试验结果与预期相符。[结论]成功建立了卡他莫拉菌的实时荧光PCR检测方法,与10种常见的呼吸道病原体无交叉反应,且重复性变异系数小于2%,模拟临床试验灵敏度结果达到1.0×10^(3)cfu/mL。     

小麦根腐病菌索氏平脐蠕孢SYBR Green I实时荧光定量PCR检测技术研究

由索氏平脐蠕孢Bipolaris sorokiniana引起的小麦根腐病,常和其他土传真菌病害混合发生,传统的症状鉴别方法很难区分,导致病害防控难度增加。为建立病菌实时荧光定量检测体系,根据ITS序列设计引物,筛选出1对特异性引物BS‐F/R,扩增片段大小为280bp。以菌丝DNA为标准品构建实时荧光定量标准曲线,并对其灵敏度、特异性、可重复性进行评价。结果表明,建立的实时荧光定量PCR检测方法速度快,灵敏度高,特异性强,重复性好。构建的荧光定量PCR标准曲线循环阈值与模板浓度呈良好的线性关系,溶解曲线的吸收峰单一,扩增效率良好。利用该定量检测体系,可以检测出田间小麦样品中52.8fg/μL的病菌DNA。     

转基因棉花MON88701品系特异性实时荧光PCR检测方法的建立

【目的】建立转基因棉花MON88701品系特异性实时荧光聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)检测方法。【方法】利用实时荧光PCR技术,根据转基因棉花MON88701品系特异性序列设计引物和探针,建立转基因棉花MON88701实时荧光PCR检测方法,并测定本方法的灵敏度、特异性及可重复性。【结果】建立的检测方法特异于转基因棉花MON88701成分的检测,灵敏度测试表明其定量下限为34拷贝;重复性试验显示其相对标准偏差在可接受范围内。【结论】本研究建立的转基因棉花MON88701品系特异性实时荧光PCR检测方法具有良好的特异性和高灵敏度,适合对转基因棉花MON88701品系进行检测。     

GA21转基因玉米实时荧光PCR检测方法的建立

成功建立了实时荧光PCR鉴定检测转基因玉米GA21品系的方法。该方法通过GA21玉米品系的OTPmEPSPS边界的270bp和133bp靶序列,设计品系特异性检测引物和探针,同时针对Pactin1mEPSPS边界的430bp靶序列设计品系特异性检测引物,应用实时荧光PCR和PCR技术,特异性检测GA21玉米品系。结果表明,应用实时荧光PCR的TaqMan探针技术检测转基因作物边界序列,不仅可以达到品系鉴定的目的,而且该方法和常规PCR比特异性强,简便快速,同时实验采用完全闭管检测,又降低了污染机会,为转基因作物的品系鉴定检测提供了新方法。     

水稻白叶枯病菌和水稻细菌性条斑病菌的实时荧光PCR快速检测鉴定

成功建立了水稻白叶枯菌与水稻细菌性条斑病菌快速检测鉴定的实时荧光PCR方法。根据含铁细胞接受子基因设计两菌的通用引物PSRGF/PSRGR（扩增一个152bpDNA片段）和特异性探针（Baiprobe和Tiaoprobe）,并对13种细菌和1种植原体进行实时荧光PCR。结果表明,两个特异性探针能分别特异性检测到目标病原菌产生荧光信号而其它参考菌不产生荧光信号。检测的绝对灵敏度是30.6fg/μL质粒DNA和103CFU/mL的菌悬浮液,相当于1个细菌细胞的基因,比常规PCR电泳检测高约100倍,相对灵敏度为105CFU/mL。整个检测过程只需2h,完全闭管,降低了污染的机会,无需PCR后处理。 用这两个特异性探针分别对自然感染白叶枯菌和条斑菌的叶片DNA提取液和种子浸泡液进行实时荧光PCR,结果均可特异性检测到目标菌的存在并完全可将两种病原细菌区分开来,且只需03g叶片和10g种子。     

实时荧光PCR检测巴西孢子丝菌的实验方法的建立

目的建立一种快速、特异、灵敏的荧光PCR方法检测巴西孢子丝菌。方法比对NCBI数据库中所有巴西孢子丝菌内转录间隔区(internal transcribed spacer, ITS)序列,在保守区域设计并合成特异性引物和探针,建立并优化荧光PCR检测方法。对优化后的方法使用标准浓度核酸进行扩增效率、灵敏度及特异度评价。通过巴西孢子丝菌小鼠感染模型,与组织培养比较,对本研究中的方法进行评价。结果建立的实时荧光PCR方法对巴西孢子丝菌的检测限为100fg。该方法对申克孢子丝菌、球形孢子丝菌、其他常见致病真菌28种、常见细菌3种以及人类基因组和小鼠基因组扩增结果均为阴性,特异度为100%。对巴西孢子丝菌感染小鼠脑、肝、肺、脾、肾及淋巴结检测与培养结果相一致。结论本研究建立的荧光PCR方法可快速、灵敏、特异地鉴定巴西孢子丝菌,并能够有效的对感染小鼠模型标本进行检测,有助于孢子丝菌病的早期特异性病原学诊断。     

实时荧光PCR法检测肉制品中鸡、鸭源性成分

根据鸡、鸭线粒体DNA(mt DNA)序列设计了鸡、鸭特异性引物及Taqman探针,建立了肉制品中鸡、鸭源性成分的实时荧光聚合酶链式(real-time PCR)检测方法。结果发现:利用此方法,两种动物源性的最低检出限值(质量分数)分别为0.01%和0.001%。实时荧光PCR法能够作为肉制品中检测鸡、鸭源性成分的有效方法。     

巴西固氮螺菌Yu62的EGFP标记及其在小麦体内的定殖研究

以质粒pEGFP-C1为模板,采用PCR方法特异性扩增增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因全长序列,将其与原核表达载体pVK-100连接,构建成重组载体pVK-EGFP.利用电转化法将重组载体导入巴西固氮螺菌Yu62中,得到EGFP标记菌株.用EGFP标记菌接种小麦'小偃107'种子,室内限菌条件下培养10 d后,用荧光显微镜观测标记菌在小麦体内的定殖规律并观察接菌植株的田间生长状况.结果显示,巴西固氮螺菌Yu62能定殖于小麦根毛区、茎组织的细胞间隙等部位,而且接菌小麦'小偃107'植株在根系发育、株高、分蘖数等方面比对照有较明显的优势.研究表明,巴西固氮螺菌Yu62能够定殖于小麦根茎内,并具有促进植物生长的作用.     

不同方法检测鸡胴体中沙门菌结果的比较研究

对鸡胴体淋洗液样品进行沙门菌检测,样品经过前增菌和选择性增菌后,分别采用4种不同的方法进行检测,即普通PCR方法、实时荧光PCR方法、免疫学方法(VIDAS)和传统的微生物检验方法。共检测了56份样品,普通PCR检出阳性样品34份,实时荧光PCR阳性样品36份,VIDAS阳性样品28份;PCR和实时荧光定量PCR均无假阳性和假阴性结果。结果显示该3种检测方法均可以用于鸡胴体中沙门菌的快速检测。     

腐皮镰刀菌SYBR Green实时荧光定量PCR快速检测方法的建立

目的建立一种能够快速、灵敏、特异的鉴定腐皮镰刀菌的SYBR Green实时荧光定量PCR。方法运用SYBR Green实时荧光定量PCR反应体系检测腐皮镰刀菌,并对此方法的特异性、灵敏度和稳定性进行评价。结果通过对45例样品的检测,结果显示SYBR Green实时荧光定量PCR特异性好,其检出率高于普通PCR;灵敏度高,对重组质粒标准品的检测灵敏度为1.0×10~2copies/μL;稳定性好,对质粒为1.0×10~7copies/μL、1.0×10~5copies/μL、1.0×10~3copies/μL的标准品重复检测10次,结果显示扩增反应Ct值的变异系数为0.96%~1.68%。结论SYBR Green实时荧光定量PCR检测腐皮镰刀菌,不仅特异性好,灵敏度高,稳定性好,而且简便、快速、易操作。     

烟草环斑病毒的定量检测技术研究

目的:建立特异、灵敏、快速的TaqMam实时荧光定量PCR方法,用于烟草环斑病毒(TRSV)的定量检测。方法:用纳米磁珠法提取病毒RNA,构建包含烟草环斑病毒全CP序列的质粒标准品。根据CP保守序列设计特异性的引物和TaqMam荧光探针,构建标准曲线,建立TRSV的实时荧光绝对定量PCR方法,并对该方法的特异性、灵敏度和重复性进行评估。结果:建立的方法特异性好,与南芥菜花叶病毒、马铃薯X病毒和马铃薯Y病毒均无交叉反应;至少能检测到767个病毒拷贝,灵敏度比普通PCR高100倍;同一样品试验内及试验间重复性实验的变异系数均小于3%,重复性好;检测结果准确可靠,构建的标准曲线有较好的线性关系(R2=0.997)。结论:建立的TRSV TaqMan实时荧光定量PCR检测方法可满足口岸高通量、快速、准确的检验检疫要求。     

转红色荧光蛋白基因唐鱼外源基因拷贝数的测定

目的:测定转红色荧光蛋白基因唐鱼的外源基因拷贝数。方法:以杂合F5代和杂合F6代转红色荧光蛋白基因唐鱼为材料,以其外源插入片段(pDsRed-mylz2)与基因组插入位点5′侧翼区之间的边界序列作为特异性内参片段,同时以外源整合的红色荧光表达载体序列(pDsRed-mylz2)作为目的基因,采用实时荧光定量PCR技术测定外源基因整合的拷贝数。结果:运用外源基因与特异内参在同批次实时荧光定量PCR中的初始拷贝数比值,得到杂合F5代和杂合F6代转红色荧光蛋白基因唐鱼中插入的外源红色荧光表达载体序列pDsRed-mylz2的拷贝数均值均为3。结论:转红色荧光蛋白基因唐鱼的外源基因拷贝数为3。     

实时荧光定量PCR法与常规细菌鉴定法检测肠道致病菌的比较

目的比较实时荧光定量PCR法与常规细菌鉴定法检测肠道致病菌中沙门菌与志贺菌的结果并分析总结。方法对江苏盛泽医院2010年到2014年就诊的腹泻患者4 662例的粪便标本同时进行实时荧光定量PCR法与常规细菌鉴定法检测,对其结果进行统计学分析,并对所有实时荧光定量PCR检测阳性标本进行常规细菌鉴定法检测,对所有结果进行分析与总结。结果实时荧光定量PCR法检测沙门菌阳性85株,阳性率为1.82%;志贺菌阳性192株,阳性率为4.12%;常规细菌鉴定法检测沙门菌阳性81株,阳性率为1.74%;志贺菌阳性184株,阳性率为3.95%,两种方法比较差异无统计学意义(P0.05)。对实时荧光定量PCR检测阳性标本进行常规细菌鉴定法检测,阳性率为100%。结论实时荧光定量PCR法检测沙门菌与志贺菌结果可靠,检测时间短,更能满足临床诊断肠道疾病的需求。     

基于16S rDNA基因的谷斑皮蠹PCR检测技术

【目的】谷斑皮蠹是一种重要的检疫性害虫,在新疆周边多个国家分布,口岸检疫人员多次从进境货物中截获谷斑皮蠹,该虫对新疆的农业生产极具威胁。【方法】以谷斑皮蠹的16S rDNA基因为靶序列,用昆虫通用引物对4种供试皮蠹进行PCR扩增,将扩增产物进行克隆和测序,用生物软件设计检测谷斑皮蠹的特异性引物与探针。【结果】设计的特异性引物(TG-SNP-F/TG-SNP-R)及所建立的常规PCR方法能有效检测出谷斑皮蠹,其扩增产物的片段大小为250 bp,灵敏度为3 ng·μL~(-1)。设计的特异性引物(TG-F/TG-R)和探针(TG-probe),以及所建立的实时荧光PCR方法,对谷斑皮蠹的检测特异性强,灵敏度达0.8 fg·μL~(-1)。【结论】建立的常规PCR方法和实时荧光PCR检测方法能够对谷斑皮蠹进行准确鉴定,为口岸检疫人员检测进境货物中携带的谷斑皮蠹提供技术支持。     

O1群霍乱弧菌实时荧光定量PCR快速检测方法的建立

目的:建立针对O1群霍乱弧菌的实时荧光定量TaqMan PCR快速检测方法,并进行模拟粪便标本的检测评价。方法:根据O1群霍乱弧菌O抗原编码基因rfb的特异性序列设计引物和TaqMan探针,建立检测O1群霍乱弧菌的实时荧光定量TaqMan PCR快速检测方法,对所建立的方法分别进行实验室内的灵敏度及特异性评价;将O1群霍乱弧菌灭活菌株悬液倍比稀释后与健康成人新鲜粪便混匀,制备成模拟带菌者粪便标本,提取DNA,进行Taq-Man PCR检测,用以评价该方法。结果:建立了快速检测O1群霍乱弧菌的实时荧光定量TaqMan PCR方法,灵敏度为每反应体系104拷贝;该方法对其他14种肠道菌DNA没有扩增;该方法对模拟粪便标本的检测灵敏度为每反应体系102 CFU。结论:建立了一种快速、高效检测O1群霍乱弧菌的荧光定量PCR检测方法,该方法可用于O1群霍乱弧菌临床粪便标本的检测。