基于EMA-qPCR的茄科青枯菌活体检测技术的建立

【目的】利用特异性核酸染料叠氮溴乙锭(Ethidium monoazide bromide, EMA)与实时荧光定量PCR技术相结合, 建立一种能有效区分青枯菌死活细胞的检测方法。【方法】样品DNA制备前经EMA渗透预处理, 再进行实时荧光定量PCR特异扩增菌体DNA。【结果】终浓度为2.0 mg/L的EMA能有效排除1.0×107 CFU/mL灭活青枯菌细胞DNA的扩增, 对活细胞和不可培养状态(Viable but non-culturable, VBNC)活菌的DNA扩增均没有影响。当每个定量PCR反应体系中的活细胞在5.0×100?5.0×104 CFU范围内时, 扩增Ct值与定量PCR反应体系中活细胞CFU对数值呈良好的负相关性(R2=0.992 5)。比较EMA-qPCR法和平板计数法对经过不同温度短期保存的青枯菌检测结果发现, 待检样品可在24 °C与4 °C冷藏条件下短期保存。【结论】本研究建立的EMA-qPCR方法能有效检测青枯菌VBNC细胞和有效区分死活菌, 避免或减少青枯菌PCR检测的假阳性和假阴性。     

人工饲养条件下眼斑芫菁不同发育阶段斑蝥素含量的变化

【目的】分析人工饲养条件下眼斑芫菁Mylabris cichorii Linnaeus不同发育阶段体内斑蝥素含量的变化。【方法】收集不同发育阶段的眼斑芫菁,通过热碱浸提法提取斑蝥素,而后以气相色谱法检测含量。【结果】在幼虫期,1龄幼虫斑蝥素相对含量最高,2龄幼虫斑蝥素相对含量降到最低点;以后随着虫体的发育,幼虫体重和斑蝥素含量都逐渐增加。羽化后的成虫经隔离饲养,雄虫在羽化后5～30天大量合成斑蝥素,而雌虫体内斑蝥素含量则极低,具有典型的性二型现象;雌雄混合饲养组中,20～30天雌虫体内可以检测到大量斑蝥素,而同期雄虫斑蝥素含量远低于隔离饲养组。【结论】幼虫期斑蝥素含量随虫体发育而增加;成虫期主要由雄虫合成斑蝥素。混合饲养组成虫平均单头斑蝥素含量高于隔离饲养组雌雄虫平均斑蝥素含量。成虫身体各部位的斑蝥素含量以腹部最高,胸部次之。     

Bt杀虫基因在桑粒肩天牛幼虫肠道内生优势菌中的转化研究

桑粒肩天牛(Apriona germariHope,Ag)幼虫是一种营钻蛀性生活的重要林业害虫,通过传统纯培养、生理生化鉴定和16SrDNA分子生物学分析等方法分离、鉴定出其肠道优势内生菌溶血葡萄球菌(Staphylococcus haem olyticus,S.haem olytic-us)Ag06菌株和人葡萄球菌(Staphylococcus hom is)Ag08菌株。从中筛选菌株S.haem olyticusAg06进行质粒消除后作为出发菌株,利用电转化技术将含有对鞘翅目昆虫具专一性毒力B t杀虫基因cry3A的Escherichia coli-Bacillus thuringiensis穿梭表达质粒pHT305 a和pHT7911分别转入其中。经质粒稳定性试验、转化子生长特性测试等分析,结果显示cry3A基因已经成功转入Ag幼虫的优势内生菌溶血葡萄球菌中。     

球孢白僵菌凝乳弹性蛋白酶(BbPr1)的纯化与特性*

以几丁质为底物,加入基本盐培养基中,诱导球孢白僵菌（Beauveriabassiana）产生分解昆虫表皮的蛋白酶。诱导物中,蝉蜕诱导的蛋白酶总活性、比活较高,经超滤、离子交换层析、亲和层析、制备性IEF电洗脱纯化了一种有凝乳弹性蛋白酶（Pr1）活性的蛋白酶BbPr1。经SDS－PAGE电泳银染后是单带,HPLC凝胶过滤显示单峰。BbPr1为单体酶,分子量为33.6kD左右,pI为7.4。底物专一性测定显示,BbPr1能水解Phe或Leu形成的酸胺键和肽键。BbPrl可被PMSF抑制,表明其活性中心有Ser残基;BbPr1还可被胰凝乳蛋白酶抑制剂TPCK和凝乳弹性蛋白酶抑制剂TEI等所抑制;胰蛋白酶抑制剂beupeptin和Epianstatin,及胃蛋白酶抑制剂Pepstain对BbPr1活性无影响。还研究了BbPr1的最适作用pH和pH稳定性。     

东亚飞蝗中肠几丁质酶基因的克隆、序列分析及组织定位

通过RACE方法,克隆了东亚飞蝗Locusta migratoria manilensis (Meyen)几丁质酶基因 (LmChi)cDNA全序列 (GenBank 登录号：EF092841)。获得的cDNA全长1 604 bp,其中可读框1 452 bp, 编码483个氨基酸。推测其氨基酸序列与18家族昆虫几丁质酶有较高的相似性。与其他几丁质酶一样,东亚飞蝗几丁质酶序列也包含一个信号肽、一个几丁质酶活性位点、一个碳端丝氨酸富集区和一个几丁质结合域。半定量RT-PCR研究表明,LmChi基因只在东亚飞蝗不同发育阶段的中肠组织中表达,而在东亚飞蝗体壁、前肠和后肠均没有发现LmChi基因的转录。     

小麦印度腥黑穗病菌和黑麦草腥黑粉菌检测标准分子构建

以小麦印度腥黑穗病菌和黑麦草腥黑粉菌为研究对象,采用分子克隆技术,分别构建了该两种真菌分子检测的标准分子。前者包括线粒体2297 bp的DNA序列以及rDNA710 bp的ITS序列,后者包括线粒体2.3kb的DNA序列以及rDNA710 bp的ITS序列。分别对该两个标准分子进行了性能评估试验,测试结果显示所构建的标准分子具有良好的特异性、均匀性和稳定性,能够满足小麦印度腥黑穗病菌和黑麦草腥黑粉菌分子检测需求。     

黄龙病菌侵染过程中柑橘CsMYB基因克隆及表达分析

MYB类蛋白是一类与植物防卫反应有关的转录因子家族,本研究利用构建的甜橙健株与感染黄龙病的病株差减（SSH）文库,采用RACE技术克隆了一个MYB类基因的cDNA全长序列,命名为CsMYB（GenBank登录号为HQ841074）。柑橘CsMYB基因的cDNA全长为1 306 bp,生物信息学分析显示,该基因包括一个909 bp的完整开放读码框以及一个典型的26 bp poly-A,编码302个氨基酸,分子量为32.97 kD,等电点为8.5。同时,还有MYB类基因的保守特征区域,即在N端有两个典型的MYB DNA结合域：R2和R3。实时荧光定量PCR分析表明,柑橘CsMYB基因受到黄龙病菌侵染后的不同时期表达量不同,伴随着黄龙病病程的变化呈现不同的表达变化。推测CsMYB基因是一个转录因子,可能参与柑橘对黄龙病菌的防御反应过程。     

亚洲韧皮杆菌兼性厌氧型伴生细菌鉴定及优势菌群分析

以定向分离培养和基于16S rDNA的PCR-DGGE (Denaturing gradient gel electrophoresis, DGGE)方法, 分析感黄龙病柑橘与健康柑橘植株不同部位的内生细菌多样性, 分离柑橘组织共获得19株可培养的兼性厌氧型内生细菌, 经形态、生理生化结合16S rDNA分子方法鉴定其隶属于12个属, 其中短小杆菌属Curtobacterium sp. (IF: 29.07%)、芽孢杆菌属Bacillus sp. (IF: 23.12%)和微杆菌属Microbacterium sp. (IF: 21.09%)为罹病植株的优势菌群, 芽孢杆菌属Bacillus sp. (IF: 21.03%)、动性球菌属Planococcus sp. (IF: 20.69%)和假单胞菌属Pseudomonas sp. (IF: 17.44%)为无症健株的优势菌群。对DGGE方法得到的50条16S rDNA目标条带进行序列比对, 共鉴定出9个属的细菌, 结果表明沙雷氏菌属Serrations sp. (IF: 28%)是优势菌属, 泛菌属Pantoea sp. (IF: 14%)是次优势菌属; 病果桔络中黄龙病菌含量最高(>1%), 而罹病植株其他部位的黄龙病菌丰度较低。PCR-DGGE 图谱也显示感病和健康柑橘组织的内生细菌存在差异。     

柑桔溃疡病菌重组单链抗体的高效表达及活性检测

运用PCR方法扩增利用核糖体展示技术筛选的抗柑桔溃疡病菌(Xanthomonas axonopodis pv.citri,XAC)的单链抗体(ScFv95)基因片段,将单链抗体基因重组到原核表达载体pET30a( )中,构建单链抗体高效表达载体pET30a( )-XAC-ScFv。再将pET30a( )-XAC-ScFv质粒转化进大肠杆菌BL21(DE3)后诱导表达,并对表达产物进行纯化、复性及活性检测。获得了抗XAC单链抗体的高效表达蛋白,以包涵体形式存在的表达蛋白大小约32kDa。包涵体蛋白经过变性、纯化和复性后,初步获得有功能的单链抗体。同时用Biacore分析XAC-ScFv-95与XAC LPS作用,结果表明复性后的XAC-ScFv-95具有较高的亲和力,从而为柑桔溃疡病菌XAC的免疫诊断和防治研究提供了新的工具和途径。     

柑橘黄龙病隐症寄主九里香内生细菌分离及功能鉴定

【目的】分析黄龙病高发区的九里香植株叶及茎干中内生细菌,为寻找具有抗柑橘黄龙病的内生细菌奠定基础。【方法】利用平板培养法及基于16S rDNA的限制性酶切长度多态性(Restriction fragment length polymorphism,RFLP)序列分子鉴定法,对九里香植物内生细菌进行多样性分析。【结果】在兼性厌氧的生长环境下,从九里香植株中分离获得可培养内生细菌26株,分属于9个细菌属的14个种,其中肠杆菌属(Enterobacter sp.)(IF=19.23%)、芽胞杆菌属(Bacillus sp.)(IF=38.46%)为九里香可培养内生细菌的优势菌属。茎干中内生细菌丰度高于叶中内生菌丰度。建立了九里香内生细菌16S rDNA文库,对文库质量检测显示,该克隆文库的覆盖度(Coverage C)为94.97%,结合Rarefaction曲线分析,表明所构建的克隆文库是相对充分的。对文库中179个阳性克隆进行HaeШ、MspⅠ、RsaⅠ3种限制性内切酶分析,得到20个不同的操作分类单元(Operational taxonomic units,OTUs),其中沙雷氏菌属(Serratia sp.)为九里香植株中内生细菌的绝对优势菌属。测定了14株内生细菌的功能,其中9株菌能产生吲哚-3-乙酸(IAA);具有抗生素(phlD)合成能力的内生细菌有4株;结合nifH和NFb固氮培养基确定有3株内生细菌具有固氮能力;1株内生细菌具有ACC脱氨酶合成能力;8株内生细菌具有铁细胞合成能力;3株内生细菌具有淀粉水解能力;2株内生细菌显示强阳性的蛋白酶合成能力,4株内生细菌具有以上4种功能。【结论】九里香植株中内生细菌具有丰富的多样性,并且可能对九里香植株生长发育及抗生物和非生物胁迫有着重要的生理功能。