葡萄糖与胰岛素对3T3-F442A脂肪细胞中Leptin表达的调节

为了解葡萄糖与胰岛素对３Ｔ３Ｆ４４２Ａ脂肪细胞中Ｌｅｐｔｉｎ表达的调节,应用ＲＴＰＣＲ方法以ｂｅｔａａｃｔｉｎ为内对照对不同葡萄糖和／或胰岛素浓度培养条件下３Ｔ３Ｆ４４２Ａ脂肪细胞中ＬｅｐｔｉｎｍＲＮＡ表达水平进行相对定量分析。结果表明葡萄糖与胰岛素对３Ｔ３Ｆ４４２Ａ脂肪细胞中Ｌｅｐｔｉｎ表达有促进作用,过高浓度的葡萄糖抑制Ｌｅｐｔｉｎ的表达及胰岛素对Ｌｅｐｔｉｎ表达的促进。葡萄糖和胰岛素对Ｌｅｐｔｉｎ表达的促进作用无协同效应,且这种促进作用表现出饱和性特点。葡萄糖浓度的变化对脂肪细胞中Ｌｅｐｔｉｎ的表达与调控具有十分重要的影响。     

粒细胞—巨噬细胞集落刺激因子／白细胞介素—3融合蛋白的表达研究

利用ＰＣＲ扩增得到粒细胞－巨噬细胞集落刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、白细胞介素－３（ＩＬ－３）完整基因片段,将其分别克隆ｐＧＥＭ－Ｔ构建成ＧＭ－ＣＳＦ／ＩＬ－３融合蛋白基因,ＤＮＡ序列与设计预期一致。将得到的融合蛋白基因克隆对７２ＲＮＡ聚合酶表达载体ｐＴ７ｚｚ,得到表达质粒ｐＦｕ,经转化至表达宿主Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）,在ＩＰＴＧ诱导下获得融合蛋白目的产物的直接表达。经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳鉴     

抗真菌蛋白Rs—AFPs基因在大肠杆菌中的表达

将抗真菌蛋白Ｒｓ－ＡＦＰ１和Ｒｓ－ＡＦＰ２全长ｃＤＮＡ插入表达质粒ｐＥＴ－２２ｂ／ＮｃｏＩ＋ＳａｃＩ位点,构建成融合蛋白表达载体ｐＲＡＦ１和ｐＲＡＦ２．将不含信号肽编码序列的Ｒｓ－ＡＦＰ１和Ｒｓ－ＡＦＰ２ｃＤＮＡ分别插入ｐＥＴ－２２ｂ／Ｎｃｏｌ＋Ｓａｃｌ和ｐＥＴ－２２ｂ／Ｎｄｅｌ＋ＳａｃＩ位点,构建成不含信号肽序列的融合蛋白表达载体ｐＲＡＦ３、ｐＲＡＦ４和非融合蛋白表达载体ｐＲＡＦ５和ｐＲＡＦ６．将构建的上述各种表达载体转化Ｅ．ｃｏｌｉＢＬ２１,挑菌落培养,ＩＰＴＧ诱导,使Ｒｓ－ＡＦＰｓ基因得到表达,并用体外抑菌试验检测表达产物的活性,结果表明,各种表达载体的表达产物均具有不同程度的抑菌活性,其中,ｐＲＡＦ３和ｐＲＡＦ４表达产物的抑菌活性较明显．     

人粒细胞集落刺激因子（hG—CSF）cDNA3‘—UTR对其表达的影响

利用人粒细胞集落刺激因子（ｈＧ－ＣＳＦ（）ｃＤＮＡ３＇端非翻译区（３＇ＵＴＲ）中存在的ＤｒａＩ酶切位点,通过部分酶切与完全酶切,删除３＇－ＵＴＲ不同长度构建了四种ｈＧ－ＣＳＦ ｃＤＮＡ瞬时重组表达质粒,转染ＣＯＳ－７细胞手,生物活性测定结果提示,ｈＧ－ＣＳＦｃＤＮＡ３＇－ＵＴＲ对其表达起负调控作用,其关键性序列位于紧接终止密码子ＴＧＡ下游的６５ｂｐ范围内,３＇－ＵＴＲ对ｈＧ－ＣＳＦ ｃＤＮＡ表达的     

人粒细胞集落刺激因子（hG－CSF）cDNA3′－UTR对其表达的影响

利用人粒细胞集落刺激因子（ｈＧ－ＣＳＦ）ｃＤＮＡ３′端非翻译区（３′－ＵＴＲ）中存在的ＤｒａⅠ酶切位点,通过部分酶切与完全酶切,删除３′－ＵＴＲ不同长度,构建了四种ｈＧ－ＣＳＦｃＤＮＡ瞬时重组表达质粒。转染ＣＯＳ－７细胞后,生物活性测定结果提示,ｈＧ－ＣＳＦｃＤＮＡ３′－ＵＴＲ对其表达起负调控作用,其关键性序列位于紧接终止密码子ＴＧＡ下游的６５ｂｐ范围内,３′－ＵＴＲ对ｈＧ－ＣＳＦｃＤＮＡ表达的影响与转录水平的差别有一定关系。     

用酵母双杂交系统研究胰岛素样生长因子—1突变体与其结合蛋白 …

为研究胰岛素样生长因子－１（ＩＧＦ１）及其突变体与ＩＧＦ结合蛋白－３（ＩＧＦＢＰ３）的相互作用,针对ＩＧＦ１的第３、４、１５、１６位氨基酸残基,采用定点突变的方法构建了「Ｙ１５Ｌ１６」ＩＧＦ１和「Ｑ３Ａ４Ｙ１５Ｌ１６」ＩＧＦ１。然后分别将ＩＧＦ１／ＩＧＦ１突变体和ＩＧＦＢＰ３ ｃＤＮＡ克隆至酵母表达载体ｐＧＢＴ９和ｐＡＣＴ２中,利用用酵母双杂交技术检测ＩＧＦ１／ＩＧＦ１突变体和ＩＧＦＢＰ３之间的相     

灵芝多糖对3T3-L1胰岛素抵抗细胞模型PI-3K p85和GLUT4蛋白表达的影响

目的 研究灵芝多糖对3T3-L1胰岛素抵抗细胞模型PI-3K p85和GLUT4蛋白表达的影响,探讨灵芝多糖改善胰岛素抵抗的分子机制.方法 3T3-L1前脂肪细胞经1-甲基-3-异丁基-黄嘌呤、地塞米松、胰岛素诱导分化成3T3-L1脂肪细胞,以葡萄糖氧化酶法测定培养液中残余的葡萄糖含量.比较二甲双胍组,检测培养液中葡萄糖含量及PI-3K p85和GLUT4蛋白表达变化.结果 地塞米松联合胰岛素诱导3T3-L1脂肪细胞产生胰岛素抵抗,细胞对葡萄糖的摄取量减少.灵芝多糖可改善3T3-L1脂肪细胞胰岛素抵抗.胰岛素抵抗细胞的PI-3K p85和GLUT4蛋白表达明显减少;应用灵芝多糖后,相关蛋白表达增加.结论 灵芝多糖通过提高PI-3K p85和GLUT4蛋白的表达,参与胰岛素抵抗状态下3T3-L1细胞的葡萄糖代谢.     

胰岛素受体的配体结合结构域的克隆与表达

用ＰＣＲ方法从人胎盘ｃＤＮＡ 中获得编码胰岛素受体α亚基中结合胰岛素的相对独立的结构域Ｌ１、Ｌ２以及人工设计的Ｌ１－（Ａｌａ）１０－Ｌ２的基因,克隆入含Ｔ７噬菌体ＲＮＡ聚合酶启动子的表达质粒ｐＥＴ－３ａ中,转化大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）,用ＩＰＴＧ诱导表达成功。ＤＮＡ测序、氨基酸组成分析以及蛋白质Ｎ端测序证明所表达的蛋白质正确。经过包涵体的分离、洗涤、溶解和纯化,得到了纯的变性状态受体的胰岛素高亲     

Mn-SOD与抗癌胚抗原单链抗体基因的融合及高效表达

将Ｍｎ－ＳＯＤ与抗癌胚抗原（ＣＥＡ）单链抗体基因（Ｓｃ－Ｆｖ ｇｅｎｅ）融合,重组到含Ｔ７启动子的表达载体ｐＥＴ－２２ｂ（＋）中,构建表达质粒ｐＥＴＭｎ－ＳＯＤ－ＳｃＦｖ,并转化大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）,进行高效表达,表达物占菌体可溶性总蛋白的２４％。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和蛋白质和迹图谱显示表达物分子量为４５ｋＤ与融合基因编码蛋白质的理论值相符。该蛋白质在大肠杆菌中为泌型表达有利于纯化。ＲＩＡ测定表     

人重组GM－CSF／HAS－D3嵌合蛋白（GM－HSA）在大肠杆菌中的表达及其产物稳定性的研究

将人粒细胞－巨噬细胞集落刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）和人血清白蛋白第三功能区（ＨＡＳ－Ｄ３）的基因串联后,在Ｅ．ｃｏｌｉ中获高效表达,表达量占菌体蛋白的３２．６％．利用ＴＦ－１体外细胞活性测定表明,ＧＭ－ＨＳＡ的活性单位为１．０４×１０~６Ｕ／ｍｇ,虽然其比活性低于ＧＭ－ＣＳＦ,但比后者具有更高的体外热稳定性和储藏稳定性．     

人重组GM—CSF／HSA—D3嵌合蛋白（GM—HSA）在大肠杆菌中的表达及其产…

将人粒细胞－巨噬细胞集落刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）和人血清白蛋白第三功能区（ＨＳＡ－Ｄ３）的基因串联后,在Ｅ．ｃｏｌｉ中获高效表达,表达量占菌体蛋白的３２．６％。利用ＴＦ－１体外细胞活性测定表明,ＧＭ－ＨＳＡ的活性单位为１．０４×１０＾６Ｕ／ｍｇ,虽然其比活性低于ＧＭ－ＣＳＦ,但比后者具有更高的体外热稳定性和储藏稳定性。     

孤儿受体TR3与人CNTF受体基因中顺式元件作用机制的研究

应用两对人工合成的寡核苷酸引物,分别通过ＰＣＲ扩增,得到了ＣＮＴＦＲα－Ｉ５ＮＢＲＥ序列两侧的两个扩增片段,将其和在ＥｃｏＲⅤ位点切开的ｐＴ７ｂｌｕｅ一起定向连接,得到了插入在ｐＴ７ｂｌｕｅ的ＥｃｏＲⅤ位点的缺失了ＮＢＲＥ序列的ＣＮＴＦＲα－Ｉ５,然后再将其切下,插入到具有ＳＶ４０起动子的ＣＡＴ基因表达载体的ＢｇｌⅡ位点,构建了ＣＡＴ报道基因．细胞转染和ＣＡＴ实验表明,缺失ＮＢＲＥ后,ＣＮＴＦＲα－Ｉ５仍具有增强子功能,ＴＲ３通过该增强子对ＣＮＴＦＲα的表达具有诱导作用,说明这种诱导作用并不是单一通过ＮＢＲＥ序列进行的．     

人白细胞介素－3在大肠杆菌中的高效表达

人白细胞介素－３（ｈｕｍａｎＩｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ３,ｈＩＬ－３）是一种造血前体细胞早期分化的关键调节因子。用ＰＣＲ方法从人Ｔ淋巴细胞ｃＤＮＡ文库中扩增出０．４４ｋｂ的ＤＮＡ片段,并克隆入ｐＵＣ１９载体中。经ＤＮＡ序列测定,确定０．４４ｋｂ的ＰＣＲ产物合完整的编码人白细胞介素－３成熟蛋白ｃＤＮＡ序列,并在信号肽与成熟蛋白编码序列之间通过突变引入了限制性内切酶位点和ＡＴＧ起始密码。构建的ＰＬ启动子控制下的ｈＩＬ－３ｃＤＮＡ表达质粒,转入大肠杆菌Ｔａｐ１０６,经４２℃热诱导,获得ｈＩＬ－３的表达产物。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳显示表达产物为１５ｋｄ,约占细菌总蛋白的１５％。表达产物经ＥＬＩＳＡ和Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ验证。ｈＩＬ－３表达产物在细胞内形成包涵体,纯化包涵体,使产物纯度提高到７０．８％,产物复性后,能明显促进ｈＩＬ－３依赖细胞株生长,具有明显的生物活性。产物转移到ＰＶＤＦ膜后进行Ｎ端序列分析,Ｎ端１６个氨基酸正确。     

人NMT的表达,纯化和活性研究

利用ＰＣＲ技术并进行ＤＮＡ序列测定,从人脑ｃＤＮＡ库中扩增得到人豆蔻酰ＣｏＡ蛋白Ｎ端豆蔻酰转移酶的编码基因,构建其在Ｔ７启动子控制下的成熟型和Ｈｉｓ６融合型的表达质粒ｐＭＦ－ｈＮＭＴ３和ｐＭＦＨＴ－ｈＮＭＴ２。转化大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）,进行ＩＰＴＧ诱导表达研究。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析结果显示,在３７℃条件下表达的各种重组ｈＮＭＲ几乎全是不溶性产物,但在较低温度条件下表达的Ｈｉｓ６－ｈＮＭＲ绝大     

人主动脉硫酸乙酰肝素蛋白聚糖对培养的人血管壁细胞生长的作用

通过培养的人主动脉平滑肌细胞（ｈＡＳＭＣ）及脐静脉内皮细胞（ｈＵＶＥＣ）,应用３Ｈ－ＴｄＲ参入、Ｎｏｒｔｈｅｒｎｂｌｏｔ分析、逆转录多聚酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）、放射免疫分析（ＲＩＡ）、和紫外比色法等技术观察了人主动脉中硫酸乙酰肝素蛋白聚糖（ＨＳＰＧ）对ｈＡＳＭＣ和ｈＵＶＥＣＤＮＡ合成的作用及对血小板源生长因子（ＰＤＧＦ）、ＰＤＧＦ受体、转化生长因子β（ＴＧＦ－β）、内皮素－１（ＥＴ－１）或碱性成纤维细胞生长因子（ｂＦＧＦ）基因表达和肾素－血管紧张系统（ＲＡＳ）的影响,结果显示,ＨＳＰＧ明显抑制培养的ｈＡＳＭＣ基础的ＤＮＡ合成（ｃｐｍ值为：１０３８５±３２６３ｖｓ,２５５４１±６４２１,Ｐ＜０．０１）及外源性ＰＤＧＦ诱导的ＤＮＡ合成（ｃｐｍ值为：９８７８±１９４７ｖｓ．１３４８１±４４ｌ０,Ｐ＜０．０５）;抑制ＰＤＧＦＡ链、ＴＧＦ－Ｂｐ和ＥＴ－１ｍＲＮＡ表达,提高ＰＤＧＦａ和β受体ｍＲＮＡ的表达;显著降低ｈＡＳＭＣ培养液中血管紧张素Ⅱ（ＡｎｇⅡ）的浓度和血管紧张素转换酶（ＡＣＥ）的活性,推测ＨＳＰＧ抑制ＰＤＧＦＡ链、ＴＧＦ－β及ＥＴ－１ｍＲＮＡ表达,降低ＡＣＥ活性及ＡｎｇⅡ浓度是其抑制ｈＡＳＭＣ增殖的重要机     

编码Synechococcus sp.PCC 7002 FNR中FNR区的基因克隆及其在大肠 …

用ＰＣＲ的方法克隆出了编码蓝细菌ＰＣＣ７００２ ＦＮＲ中ＦＮＲ区的基因克隆到达载体ｐＥＴ－３ａ上转化大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）后实现了大量表达。重组ＦＮＲ组经ＤＥＡＥ－Ｓｅｐｈｄｅｘ Ａ－５０离子交换层析及Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－１００凝胶层析得到大量的电泳均一的ｒＦＮＲＤ。Ｎ末端氨基酸序列分析表明,表达产物确为ｐｅｔＨＬ所编码且起始Ｍｅｔ翻译后末被除去,ｒＦＮＲＤ与ｒＦＮＲ的吸收光谱相同,其黄递酶     

［B1－Ala，B2－Ala］－胰岛素：受体结合特性及生物活力研究

本文报道了［Ｂ１～Ａｌａ,Ｂ２－Ａｌａ］－胰岛素与人胎盘细胞膜胰岛素受体结合的特性和体外生物活力,并与胰岛素进行比较。在３７℃和杆菌肽存在下,１２５Ｉ－［Ｂ１－Ａｌａ,Ｂ２－Ａｌａ］－胰岛素和１２５Ｉ－胰岛素与人胎盘细胞膜作用依赖于反应时间,反应６分钟到达平衡,此时,［Ｂ１－Ａｌａ,Ｂ２－Ａｌａ］－胰岛素和胰岛素与胰岛素受体的最大结合分别为每毫克膜蛋白结合６．４４ｆｍｏｌ和３．４７ｆｍｏｌ：达到平衡一半所需时间（Ｔ１／２）分别为１９秒和２５秒。用１２５Ｉ－［Ｂ１－Ａｌａ,Ｂ２－Ａｌａ］－胰岛素作为放射配体进行竞争性结合研究,从ＩＣ（５０）得［Ｂ１－Ａｌａ,Ｂ２－Ａｌａ］胰岛素的受体结合活力为胰岛素的１３９．６％。Ｓｃａｔｏｈａｒｄ分析求得;［Ｂ１－Ａｌａ,Ｂ２－Ａｌａ］－胰岛素与高亲和和低亲和结合位点的结合常数在４℃时分别为５．８８×１０８Ｌ／ｍｏｌ和７．６３×１０５Ｌ／ｍｏｌ,而胰岛素分别为４．８３×１０８Ｌ／ｍｏｌ和３．３９×１０５Ｌ／ｍｏｌ。促脂肪细胞生成脂的实验表明：［Ｂ１－Ａｌａ,Ｂ２－Ａｌａ］－胰岛素的活力为胰岛素的１３０％。     

人GM—CSF cDNA的克隆和在大肠杆菌中的表达

从诱导的人胚肺细胞ＨＦＬ株中提取总ＲＮＡ．经ＲＴ－ＰＣＲ反应获取了人ＧＭ－ＣＳＦｃＤＮＡ,ＤＮＡ序列测定表明其顺序与文献报道完全一致。为了获得高效表达,应用ＰＣＲ改造了人ＧＭ－ＣＳＦ的ｃＤＮＡ５’端核苷酸序列,并将改造的人ＧＭ－ＣＳＦ基因插入含Ｔ７启动子的质粒ｐＥＴ－１１ｄ构建成表达质粒ｐＥＴＣ－５,将此质粒转化大肠杆菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）得到表达菌株ＢＬＥＣ４。表达菌株用０．５ｍｏｌ／ＬＩＰＴＧ诱导２小时后,产生大量重组蛋白并形成包涵体。ＳＤＳ—ＰＡＧＥ电泳图谱扫描结果表明,ｒｈＧＭ－ＣＳＦ产量占菌体总蛋白量的１６％。ＥＬＩＳＡ和ＴＦ－１细胞培养测定表明,初步纯化和复性的ｒｈＧＭ－ＣＳＦ具有天然的ｈＧＭ－ＣＳＦ生物活性。     

Forskolin对放射性转化细胞TGF基因及部分癌基因表达的影响

＾３Ｈ－ＴｄＲ放射性转化细胞经１×１０＾－５ｍｏｌ／Ｌ Ｆｏｓｋｏｌｉｎ处理２４ｈ后,ＴＧＦａ,ｃ－ｍｙｃ,ｃ－Ｋ－ｒａｓ基因的ｍＲＮＡ表达下降;ＴＧＦβ,ｃ－ｆｏｓ基因表达无明显变化。非转化细胞经相同条件处理,ＴＧＦａ,ＴＧＦβ,ｃ－ｍｙｃ及ｃ－Ｋ－ｒａｓ基因表达无显著改变。提示：Ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ介导的转化细胞的生长抑制作用与ＴＧＦａ,ｃ－ｍｙｃ,ｃ－Ｋ－ｒａｓ基因的转录表达下降有关。     

c-fos基因在内皮素-1促肺泡Ⅱ型细胞表面活性物质合成中的作用

应用反义技术探讨ｃ－ｆｏｓ基因ＥＴ－１调控肺泡Ⅱ型细胞（ＡＴⅡ）表面活性物质（ＰＳ）合成的胞内信号转导中的作用,结果显示：（１）内皮素－１（ＥＴ－１）可提高ＡＴⅡ细胞的＾３Ｈ－胆碱掺入。（２）蛋白激酶Ｃ（ＰＫＣ）激活剂ＰＭＡ可使ＡＴⅡ细胞的＾３Ｈ－胆碱掺入量增加,ＰＫＣ抑制剂Ｈ７可抑制ＥＴ－１的促ＰＳ合成效应。（３）ＥＴ－１和ＰＭＡ可显著提高Ｆｏｓ蛋白表达量,Ｈ７和ｃ－ｆｏｓ反义寡核苷酸（ＯＤＮ）