氯化钠对培养的大鼠主动脉平滑肌细胞的心房钠尿肽受体的调节

培养的卒中型自发性高血压大鼠(SHR_(sp))及其对照 WKY 大鼠主动脉平滑肌细胞(VSMC)上存在心房钠尿肽(ANP)的特异性受体,它们与~(125)I-ANP 的最大结合量(B_(max))是:SHR_(sp)3.65±0.13和 WKY 1.89±0.09 pmol/mg pr(P<0.01);解离平衡常数(Kd)值分别是72.6±10.2和42.0±4.8×10~(-12)mol/L(P<0.01)。 两种细胞内介导舒血管作用的第二信使、环磷酸乌苷(cGMP)的基础浓度无显著差异,对相同剂量 ANP 刺激引起 cGMP 分别增加139(SHRsp)和271(WKY)倍。可见 SHRsp 的 VSMC ANP 受体数量虽比 WKY大鼠增多,但对相同剂量 ANP 引起的 cGMP 增加反应及 ANP 受体的亲和力均显著降低。高盐培养液孵育24h 后,细胞表面 ANP 受体的亲和力改变不明显,但受体数量下调,SHRsp 和 WKY 大鼠分别降至对照的34.8±8.2%和38.6±9.4%,细胞对 ANP 引起的 cGMP增加反应明显降低,且均以 SHR_(sp)较显著。提示后两种变化可能在高盐促进血压升高的机制中起作用。     

ILK—整合素信号传导通路中的关键激酶

胸外基质与细胞的相互作用主要由整合素介导。由整合素介导的机械和生化信号调控胞浆激酶、生长因子受体、离子通道的活性并掏胞内肌动蛋白细胞骨架的组装。众多由整合素介导的信号传导通路最后可归于对细胞周期的调节、决定细胞存活或死亡、增殖或者退出细胞周期和分化。近年的研究发现,整合素连接激酶（inte-grin-linked kinase,ILK）在这些信号传导通路中具有关键作用。     

携带反义凝血酶受体和p21双基因共表达腺病毒伴随病毒载体的构建与包装

为探讨双基因共表达对再狭窄的防治作用,分别构建了含反义凝血酶受体(ATR)或/和p21单、双基因及报告基因绿色荧光蛋白(GFP)的腺病毒伴随病毒(AAV)载体.上述载体经脂质体介导转染BHK-21细胞, G418筛选获得整合有外源基因的细胞株.克隆形成过程中显示单、双基因转染后细胞增殖受到了不同程度的抑制,克隆形成速度减慢,细胞形态改变,且双基因的作用明显大于单基因.以绿色荧光出现说明报告基因得到表达后,又以DNA印迹证实ATR和p21单、双基因已整合于细胞基因组中,并维持了凝血酶受体(TR)基因的反义位置.半定量RT-PCR证实TR基因表达降低,p21基因表达升高,ATR和p21(AP)双基因得到了共表达.以具有可提供复制和包装功能的重组单纯疱疹病毒rHSV-rc/ΔU12分别感染载有不同基因的BHK细胞株,包装产生重组AAV(rAAV)病毒, 并经点杂交法测定其滴度(每毫升病毒液中所含病毒颗粒数).rAAV/AP中ATR与p21的病毒颗粒数分别为1.02×10¹³/ml和1.08×10¹³/ml, 单基因rAAV/ATR的滴度为6.54×10¹²/ml,rAAV/P21为1.06×10¹³/ml,为进一步的体内外实验奠定了物质基础.     

多基因共表达载体的构建策略

于同一载体上同时表达多个外源基因在生物学领域中有广泛的应用价值,尤其在针对疾病发生发展的各个环节设计的联合基因治疗方案中,构建合适的载体获得多个外源基因的高效转移与表达具有重要意义,目前可提供的载体难以满足这一要求,近年来在多顺反子表达载体的构建策略方面有许多新的进展,本文拟对多基因共表达载体的构建策略予以总结和阐述。     

反义凝血酶受体基因的表达对人ASMC增殖的影响

介入治疗后再狭窄的发生严重降低了该治疗手段的最终疗效．为探讨再狭窄的发生机理、寻找有效的预防手段,利用反义ＲＮＡ技术构建了含有部分反义凝血酶受体（ＡＴＲ）ｃＤＮＡ片段的真核表达质粒ｐｃＤＮＡ３／ＡＴＲ,并观察了其对培养的人主动脉平滑肌细胞（ＡＳＭＣ）增殖的影响．结果表明ｐｃＤＮＡ３／ＡＴＲ的瞬时转染即能显著抑制人ＡＳＭＣ的３Ｈ－ＴｄＲ参入量,且该作用与导入的ＤＮＡ量呈剂量依赖性．说明部分反义凝血酶受体基因的表达可以抑制ＡＳＭＣ的增殖     

764－3对血管平滑肌细胞增殖的影响

为寻找新型有效的ＡⅡ拮抗剂,本实验应用细胞计数、￣３Ｈ－ＴｄＲ掺入、逆转录─聚合酶链反应及放射免疫实验方法,研究了中药单体７６４－３对卒中易感型自发性高血压大鼠（ＳＨＲｓｐ）及其对照（ＷＫＹ大鼠）主动脉平滑肌细胞（ＡｓＭＣ）增殖的影响及其作用机制。结果表明：７６４－３可显著抑制ＡＳＭＣ增殖,并有剂量依赖性。２０ｍｇ／Ｌ的７６４－３可极显著地抑制ＡＳＭＣ上ＡⅡ受体（ＡＴ＿１）的ｍＫＮＡ表达（ＳＨＲｓｐ下降７６．３％,ＷＫＹ大鼠下降６１．６％）,并可降低ＳＨＲｓｐＡＳＭＣ内ＡⅡ含量（下降２０％）。推测７６４－３对ＡＳＭＣ增殖的抑制作用可能部分地是由于降低了ＡＴ＿１受体的基固表达引起。比较其对两种大鼠ＡＳＭＣ的抑制效率,发现它对ＳＨＲｓｐ的ＡＳＭＣ的作用更强。     

心肌特异性新蛋白激酶p93和peroxiredoxin 3的相互作用

为了明确p93在心血管系统中的生物学功能及在信号传导通路中的作用,采用酵母双杂交技术,选择p93 N端第101～372位氨基酸构建诱饵质粒,筛选成人心脏cDNA文库,寻找与之相互作用的蛋白质,结果得到蛋白peroxiredoxin 3（PRX 3）.采用体外结合实验和免疫共沉淀等方法,证实了原核和真核表达的p93确实可与PRX3相互作用,通过双重荧光共定位,为二者的相互作用提供了定位依据.研究提示p93可能参与心肌细胞中与PRX3有关的各种生理病理过程,如生长、分化、发育、凋亡、氧应激等.     

大鼠侧脑室注射高渗盐水引起血压上升过程中心房钠尿肽和血管升压素的变化

为研究中枢渗透压刺激升压的机制,在大鼠侧脑室内给予高滲人工脑脊液,记录颈动脉压和心率变化,给药10min 后,用放射免疫法测定血浆、下丘脑和垂体中的心房钠尿肽和升压素。结果表明:中枢给予高渗人工脑脊液后,血浆中升压素水平明显增加,心房钠尿肽没有明显改变,下丘脑和垂体中的心房钠尿肽含量增加,而升压素含量下降。     

764—3对血管平滑肌细胞增殖的影响

为寻找新型有效的AⅡ拮抗剂,本实验应用细胞计数,^3H-TdR掺入,逆转录－聚合酶链反应及放射免疫实验方法,研究了中药单体764－3对卒中易感型自发性高血压大鼠（SHRsp)及其对照（WKY大鼠）主动脉平滑肌细胞（ASMC）增殖的影响及其作用机制,结果表明：764－3可显著抑制ASMC增殖,并有剂量依赖性,20mg/L的764－3可极显著地抑制SMC上AⅡ受体（AT1）的mRNA表达（SHRsp下降76．3％,WKY大鼠下降61．6％）,并可降低SHRsp ASMC内AⅡ含量（下降20％）,推测764－3对ASMC增殖的抑制作用可能部分地是由于降低了AT1受体的基因表达引起,比较其对两种大鼠ASMC的抑制效率,发现它对SHRsp的ASMC的作用更强。