人粒细胞集落刺激因子（hG－CSF）cDNA3′－UTR对其表达的影响

利用人粒细胞集落刺激因子（ｈＧ－ＣＳＦ）ｃＤＮＡ３′端非翻译区（３′－ＵＴＲ）中存在的ＤｒａⅠ酶切位点,通过部分酶切与完全酶切,删除３′－ＵＴＲ不同长度,构建了四种ｈＧ－ＣＳＦｃＤＮＡ瞬时重组表达质粒。转染ＣＯＳ－７细胞后,生物活性测定结果提示,ｈＧ－ＣＳＦｃＤＮＡ３′－ＵＴＲ对其表达起负调控作用,其关键性序列位于紧接终止密码子ＴＧＡ下游的６５ｂｐ范围内,３′－ＵＴＲ对ｈＧ－ＣＳＦｃＤＮＡ表达的影响与转录水平的差别有一定关系。     

SHP-2酪氨酸磷酸酶激活突变促进组织白细胞浸润和器官损伤

目的观察SHP-2^D61G/＋酪氨酸磷酸酶激活突变对组织白细胞浸润、细胞因子分泌及多器官损伤的影响。方法分别以SHP-2^D61G/＋激活突变敲入的模型小鼠和野生型C57BL／6小鼠为研究对象,ELISA法检测小鼠血清和白细胞培养上清液中IL-2及TNF-α浓度;采用常规组织切片和HE染色观察心、肺、脾等组织病理学改变;放射免疫法检测血清中丙氨酸转氨酶和心肌肌钙蛋白Ⅰ的水平。结果SHP-2^D61G/＋激活突变小鼠脾、肺组织中白细胞浸润较野生型对照小鼠明显增加,心肌肥大,出现明显炎症损伤型组织学变化;与野生型对照相比,突变小鼠血清及白细胞培养上清液中IL-2和TNF-α浓度均显著增加（P＜0．01）,血清丙氨酸转氨酶及心肌肌钙蛋白Ⅰ水平亦显著增高（P＜0．01）。结论SHP-2^D61G/＋激活突变增强白细胞分泌炎症因子的能力,促进组织白细胞严重浸润和脾、肺、心等多器官损伤,进而导致多器官功能障碍。     

PCR技术在鉴定阳性重组子中的应用

阳性重组子的筛选与鉴定是分子克隆实验中经常遇到的一个重要问题。DNA片段连接产物转化感受态大肠杆菌后经相应抗生素抗性粗筛后,为了鉴定转化子中插入片段的存在,目前常采用的方法有:①通过特异探针从菌落原位杂交筛选。②通过快提质粒DNA后,依据分子量大小及酶切图谱进行鉴定。但这两种方法均存在各自的不足。如:周期较长,需进行同位素操作,当载体分子量太大而插入片段较小     

人粒细胞集落刺激因子（hG—CSF）cDNA3‘—UTR对其表达的影响

利用人粒细胞集落刺激因子（ｈＧ－ＣＳＦ（）ｃＤＮＡ３＇端非翻译区（３＇ＵＴＲ）中存在的ＤｒａＩ酶切位点,通过部分酶切与完全酶切,删除３＇－ＵＴＲ不同长度构建了四种ｈＧ－ＣＳＦ ｃＤＮＡ瞬时重组表达质粒,转染ＣＯＳ－７细胞手,生物活性测定结果提示,ｈＧ－ＣＳＦｃＤＮＡ３＇－ＵＴＲ对其表达起负调控作用,其关键性序列位于紧接终止密码子ＴＧＡ下游的６５ｂｐ范围内,３＇－ＵＴＲ对ｈＧ－ＣＳＦ ｃＤＮＡ表达的     

hEPO cDNA重组逆转录病毒的构建

通过DNA重组技术,将不含非编码区的hEPO cDNA片段重组到逆转录病毒质粒pLXSN, pLNCX中重组质粒转染PA317细胞后,经G418筛选,抗性克隆细胞培养上清能成功地感染NIH3T3细胞,使之在筛选培养基中形成典型的G418抗性克隆,该克隆细胞染色体中成功地整合了EPOcDNA,并且表达出有生物学活性的红细胞生成素(EPO)产物。     

中国人γ－干扰素cDNA在大肠杆菌中的高效表达

应用RT-PCR技术从中国人淋巴细胞mRNA反转录产物中克隆了IFN-γcDNA,序列分析证实了分子进化规律对IFN-γcDNA序列存在多态性的推论.在此基础上应用DNA重组技术,将去信号肽中国人IFN-γcDNA克隆到原核表达质粒pBV220 P_RP_L启动子下游,转化大肠杆菌DH5α,通过温度诱导表达,成功地在大肠杆菌中稳定、高效地表达了中国人IFN-γcDNA,其表达水平占全菌可溶性总蛋白的44.4%,初步复性后生物学活性测定结果表明γ-IFN表达量为0.45×10⁷～2.34×10⁷单位/L.     

一种高效感染血液细胞的新型靶向性腺病毒载体的构建

人C组5型腺病毒(Ad5)载体能够有效感染上皮来源的细胞,但对造血细胞的感染效率很低,限制了其在造血调控基础研究以及血液病基因治疗中的应用。为了建立高效感染血液细胞的新型靶向性腺病毒载体系统,对5型腺病毒载体的纤维顶球进行了改造,以AdEasy系统为基础,应用递归PCR的方法人工合成人B组11p型腺病毒的部分纤维(fiber)基因,采用一系列分子生物学方法将其替换AdEasy骨架质粒中的人5型腺病毒的fiber基因,得到新的腺病毒骨架质粒命名为pAdEasy-1/F11p,应用带有GFP报告基因的穿梭质粒pShuttle-GFP与AdEasy-1/F11p腺病毒DNA在BJ5183细菌内重组得到重组腺病毒质粒,将其转染293细胞获得重组腺病毒,命名为Ad5F11p-GFP。以Ad5-GFP作对照,同时感染K562、U937等白血病细胞系,流式细胞仪检测GFP的表达。初步检测结果显示:在10MOI时,Ad5F11p-GFP能够有效感染K562、U937等白血病细胞系,感染细胞效率>90%,对照Ad5-GFP感染细胞效率<30%,这表明改建后的腺病毒AdEasy-1/F11p可以高效介导基因转移到血液细胞,是一种很好的血液细胞靶向性腺病毒载体。     

中国人r——干扰素cDNA在大肠杆菌中的高效表达

应用ＲＴ－ＰＣＲ技术从中国人淋巴细胞ｍＲＮＡ反转录产物中克隆了ＩＦＮ－ｒ－ｃＤＮＡ,序列分析证实了分子进化规律对ＩＦＮ－ｒｃＤＮＡ序列存在多态性的推论。在此基础上应用ＤＮＡ重组技术,将去信号肽中国人ＩＦＮ－ｒ ｃＤＮＡ克隆到原核表达质粒ｐＢＶ２２０ ＰＲＰＬ启动子下游,转化大肠杆菌ＤＨ５ａ,通过温度诱导表达,成功地在大肠杆菌中稳定、高效地表达了中国人ＩＦＮ－ｒ ｃＤＮＡ,其表达水平占全菌可溶性总     

▽5-人粒系集落刺激因子(▽5-hG-CSF)的cDNA克隆、序列测定与表达

从LPS刺激的正常中国人外周血单核细胞中提取mRNA,经反转录(RT)-PCR扩增出不含信号肽和成熟型N端5氨基酸(V5-hG-CSF)的cDNA片段,酶切后组入大肠杆菌表达载体pJLA602中。序列测定表明,克隆片段与国外报道的高活性hG-CSF cDNA序列一致。重组子经诱导表达、小鼠骨髓细胞体外CFU-G测试表明,表达产物具明显的粒细胞集落刺激活性。