大足鼠耳蝠短波视蛋白基因的RACE扩增及其进化分析

根据几种哺乳动物的短波视蛋白基因的比对结果,在保守区设计两条基因特异引物扩增大足鼠耳蝠(Myotis ricketti)的短波视蛋白基因,用cDNA末端快速扩增技术(rapid amplincation of cDNA ends,RACE)扩增出其5′和3′末端序列,并结合GenBank中相关哺乳动物短波视蛋白基因编码区进行了进化分析.结果显示,该基因编码区全长为1 050 bp,共编码350个氨基酸.没有发现提前终止密码子,且功能区严格保守,提示是一个有功能的基因;5个关键氨基酸位点分别为52 T、86 F、93 T、114 A和118 S,表明该蝙蝠的短波视蛋白对紫外光最敏感.进化分析表明,兽类的短波视蛋白基因受到正选择压力的影响;相对速率检验结果显示,大足鼠耳蝠与其他兽类的短波视蛋白基因进化速率有明显的差异.提示大足鼠耳蝠的该基因可能发生了功能特化,可能对其夜晚视觉有重要的作用.     

一个推测的拟南芥漆酶基因在巴斯德毕赤酵母中的表达

At5g01040基因是一个推测的拟南芥漆酶基因。根据其编码序列设计引物,利用RT—PCR方法扩增出1755bp的片段。测序结果表明,该片段存在3个突变位点,其中一个突变位点改变了所编码的氨基酸。将该片段克隆到表达载体pPICZaB上,电击转化毕赤酵母。经筛选获得80个候选重组菌株,其中18个菌株的培养液中存在漆酶活性,说明所克隆的基因在毕赤酵母中实现了分泌表达,证实了At5g01040编码的蛋白具有漆酶活性。     

巴西橡胶树(Hevea brasiliensis)微管相关蛋白全长cDNA克隆及表达分析

从巴西橡胶树Hevea brasiliensis差减cDNA文库中分离到微管相关蛋白（Microtubule-associated protein,MAPs）基因片段,根据该基因片段序列信息,设计特异引物,采用cDNA末端快速扩增技术RACE（Rapid Amplification ofcDNA Ends）进行差异片段的5＇和3＇端的扩增,获得了长度为788bp的全长cDNA,该基因在GenBank中的登录号为AY461412.序列分析表明该基因包含完整的开放阅读框,编码144个氨基酸,与微管相关蛋白基因家族具有很高的同源性,推测该基因是微管相关蛋白基因.半定量RT-PCR检测证实它在胶乳中的表达强于叶中,胁迫处理（伤害及乙烯处理）使其表达上调.     

甘薯贮藏蛋白(sporam in)A基因编码区克隆及序列同源性分析

采用 PCR技术 ,从我国广泛栽培甘薯品种南薯 88基因组中扩增和克隆到甘薯贮藏蛋白 A基因编码区段 ,并测定了其全部核苷酸序列 .该编码区长 65 7bp,编码一个长 2 1 9个氨基酸残基的蛋白质 ,其中信号肽长 37个氨基酸残基 ,成熟蛋白质长 1 82个氨基酸残基 ,其分子量为 2 0 k D.将该片段的核苷酸序列与已登录在 Gen Bank中的另外 6个甘薯贮藏蛋白 A基因编码区序列进行比较 ,发现其同源性高达 90 % ,说明甘薯贮藏蛋白 A基因编码区序列具有高度保守性 .虽然 7个基因编码区的核苷酸总变异为 1 0 % ,但在每两个基因之间的比较则表明其核苷酸的变异范围小于 7% .     

人脑内-含有ACP样结构域新基因的发现

为寻找脑内新基因,以正常成人全脑cDNA为模板,采用锚定PCR方法进行扩增,将经琼脂糖DNA电泳 鉴定获得的一约1200bp大小的特异性条带回收,并克隆入Teasy载体.用310 Genetic Analyzer进行自动测序. 所得序列进行生物信息学分析BLAST相似性分析结果证明所得序列为新序列,读框分析表明,该序列中存在 一完整编码区,编码含357个氨基酸的蛋白质.ProDom软件分析发现其含有酰基携带蛋白(ACP)样结构域. 随后,经3'RACE法克隆到该基因的全长cDNA,其全长为2024bp,染色体定位在14q11.2,含有16个外显子, 15个内含子,该基因已登录到GenBank.经设计编码区引物,从Teasy载体扩增出编码区后再克隆入pGEX-4T1 表达载体,经异丙基硫代-D-乳糖苷(IPTG)化学诱导表达.其编码区克隆人pGEX-4T1表达载体后,转入 JM109宿主菌,经IPTG诱导已得到表达.点杂交及RNA印迹表明,该基因在正常成人脑内广泛高表达.     

产植酸酶菌株的筛选及其植酸酶基因的克隆

从土壤中筛选到产植酸酶活性较高的烟曲霉菌株WY-2,其植酸酶最适pH为5.5,最适温度为55℃。通过对烟曲霉WY-2植酸酶基因进行PCR扩增,获得了一个1.5kb大小的特异性产物,将其克隆到载体pMD18-T中。测序结果分析表明,该基因片段含有植酸酶基因完整的阅读框架(ORF),基因全长1459bp,其中包含一个61bp的内含子,编码465个氨基酸,有7个潜在的糖基化位点,5′端有一编码26个氨基酸的信号肽序列。该基因与已报道的烟曲霉ATCC34625植酸酶基因有91%同源性,编码的氨基酸序列同源性为91%。     

人牛精浆蛋白相关新基因的cDNA克隆、定位和表达

为了研究牛精浆 (bovineseminalplasma ,BSP)蛋白及其相关蛋白在受精及受精卵发育中的重要作用 ,寻找BSP蛋白相关新基因 .采用cDNA末端快速扩增 (RACE)技术 ,克隆了一个BSP蛋白相关基因的cDNA序列 .应用辐射杂种细胞系 (RH)技术进行了基因染色体定位 .通过RT PCR检测了该基因在人体各组织中的表达情况 .并将该基因编码的蛋白进行了原核表达 .新基因的cDNA长度为 10 5 2bp ,其开放阅读框架 (ORF)编码了一个含 2 2 3个氨基酸残基的蛋白质 ,氨基酸序列中含有 4个纤连蛋白Ⅱ结构域 ,与BSP蛋白在结构上具有一定的相似性 ,称其为人BSP相关蛋白 (humanBSP relatedproteins ,HBRP) .该基因定位于染色体 19q13,在大肠杆菌中表达为 5 2kD的融合蛋白 .研究结果提示 ,应用RACE方法克隆了一种新的人类与BSP蛋白相关的基因 ,推测其编码蛋白是与BSP蛋白功能相关的结合蛋白 ,通过基因重组技术大量获得表达蛋白 ,对进一步研究新蛋白的生物学功能具有重要的意义 .     

β2-肾上腺素能受体基因的克隆及序列分析

目的:克隆β2-肾上腺素能受体(β2-AR)全长基因片段.方法:根据GenBank中收录的猪β2-AR cDNA序列设计一对引物,以猪肝脏组织总RNA为模板,利用RT-PCR技术扩增目的基因,将其与pUC18载体体外连接,转化感受态大肠杆菌E.coil DH5α,筛选阳性克隆.结果:扩增出一条1257 bp的目的基因片段,该片段编码418个氨基酸.与CenBank中收录的猪β2-AR序列比对,其同源性为99.52%,编码的氨基酸有99.04%相同.结论:成功获得了β2-AR全长基因片段,为该基因的表达和受体筛药模型的建立奠定基础.     

变色栓菌漆酶基因的克隆与序列分析

本研究以PCR扩增的方法,从变色栓(菌Trametes versicolor)的基因组DNA中扩增出了一预期大小的DNA片断,并将其克隆到了pUCM-T载体上。经筛选、酶切、PCR鉴定,序列分析,证明该片断为变色栓菌漆酶基因的克隆。该基因的开放阅读框由1560个核苷酸组成,编码一个由519个氨基酸组成的多肽。与GeneBank中发表的Laccase基因(AY081188)序列比较发现,编码的氨基酸序列同源性为96%,而核苷酸序列的同源性为92%。     

成人视网膜假定蛋白基因ARHP的克隆及生物信息学分析

从UniGene库中选取编号为BG2 2 2 62 4来自人鼻咽组织的表达序列标签 (EST )序列 ,联网到NCBI调用Blast服务器分析 ,发现该EST序列是一个代表新基因的未知序列 .利用Blast检索GenBank的nr数据库和EST数据库 ,构建EST重叠群 ,联网到NCBI的ORFfinder服务器 ,分析发现该EST重叠群具有完整的阅读框架 .分别在cDNA序列阅读框架的起始密码子和终止密码子的两侧设计引物 ,以人胎脑cDNA文库为模板 ,进行PCR扩增 ,测序确定该基因的cDNA全长序列 .该基因cDNA序列全长为 1672bp ,阅读框架位于第 3 0 4～ 1557位之间 ,编码由 417个氨基酸组成 ,分子质量为 46 58ku的蛋白质 ,其理论 pI为 4 2 1.将蛋白质序列通过NCBI的Blast服务器进行序列相似性分析 ,发现该基因编码的蛋白质和成年小鼠视网膜未知蛋白 (BAB3 2 2 14 )同源 .经与国际人类基因组命名委员会协商定名为成人视网膜假定蛋白 (adultretinahypotheticalprotein ,ARHP) ,GenBank登录号为AY174896.生物信息学分析表明 ,该蛋白质可能为一参与转录调控的核蛋白 .ARHP基因定位在染色体 5q3 5,跨越 3 5163bp ,含 4个外显子和 3个内含子 .在基因的 5′非翻译区有 2个CpG岛     

人可溶性APRIL基因的克隆、表达及生物学活性检测

为探索人可溶性增殖诱导配体 (sAPRIL)在多种肿瘤细胞的增殖和存活以及促肿瘤形成中的作用 ,用RT PCR从扁桃体总RNA中扩增出人sAPRIL基因 .经克隆测序后进行同源性比较 ,证实所克隆的基因即为sAPRIL .将克隆载体经酶切并构建表达载体 ,在大肠杆菌中表达 ,表达量达4 3 6 % .纯化蛋白后进行3 H TdR参入实验 ,表明sAPRIL有明显促进肿瘤的形成及肿瘤细胞的增殖与存活的作用 .     

肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体(TRAIL)cDNA的克隆、表达和活性测定

肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体 (TRAIL)能选择性诱导肿瘤细胞凋亡 .为利用基因工程技术获得重组TRAIL蛋白可溶性片段 (sTRAIL) ,设计 1对引物 .利用PCR技术特异性扩增出sTRAIL的cDNA ,克隆于质粒pGEM 3Zf( )的EcoRⅠ和PstⅠ位点 .经测序证明序列正确后克隆于表达质粒pBV2 2 0的EcoRⅠ和PstⅠ位点 ,转化大肠杆菌DH5α .转化菌株经温度诱导 ,SDS PAGE检测和Western印迹鉴定 ,获得重组sTRAIL的高水平非融合表达菌株 .表达量占菌体总蛋白的 2 0 % .对其表达产物进行了初步纯化 ,SDS PAGE结果显示纯度可达 90 %以上 .用L92 9细胞测定其生物学活性表明 ,重组蛋白在体外能明显诱导肿瘤细胞凋亡     

凋亡抑制因子Survivin在大肠杆菌TB1中的表达纯化及鉴定

 本文旨在克隆凋亡抑制因子Survivin基因,并在大肠杆菌中进行可溶性表达与初步纯化. 采用RT-PCR法,扩增人凋亡抑制因子survivin cDNA,并克隆入原核表达载体pMAL p2X中,转化TB1大肠杆菌感受态细胞.经0.3 mmol/L IPTG诱导2 h后,收集菌体蛋白,进行SDS-PAGE、ELISA及Western 印迹鉴定. 实验获得凋亡抑制因子survivin编码区cDNA,以构建的原核表达载体pMAL-p2X survivin转化菌株后,可表达凋亡抑制因子survivin和麦芽糖结合蛋白(MBP)的融合蛋白,相对分子质量(Mr) 为58 000.并成功利用Factor Xa将融合蛋白裂解开.ELISA和Western 印迹表明,融合蛋白能与抗凋亡抑制因子survivin单克隆抗体特异性结合.获得的凋亡抑制因子survivin全长cDNA可在大肠杆菌TB1中以MBP survivin融合蛋白的形式表达,成功地将survivin目的蛋白和MBP蛋白分离,为深入研究survivin的结构和功能奠定了基础.     

人蛋白激酶CK2α′亚基在大肠杆菌中的克隆、表达及其重组蛋白的纯化与性质鉴定

通过RT PCR从HL 6 0细胞获得人蛋白激酶CK2α′亚基编码区cDNA ,将NdeⅠ HindⅢ双酶切的PCR产物和pT7 7表达载体进行定向克隆、细菌转化、电泳初筛和限制性酶切分析鉴定 .随机挑选阳性克隆进行DNA测序确证 ,筛选含与已知序列完全相符的重组质粒 (命名为pTCKA′) .将其转化BL2 1(DE3)菌 ,IPTG诱导后未见高效特异表达 .然后将人CK2α′cDNA亚克隆至GST融合蛋白表达载体 ,经同样转化和诱导步骤后可见一蛋白特异高效表达 .Western印迹结果证明 :该蛋白能与兔抗人CK2α′3 3 3 3 50 肽段抗血清发生特异性免疫反应 .采用GSH Sepharose 4B柱纯化 ,凝血酶酶切 ,最后从 4g细菌获 4 4mg纯化重组蛋白 .通过性质鉴定和酶动力学分析证明 :克隆、表达和纯化的重组蛋白是有生物学活性的人CK2α′亚基 .     

组织因子膜外区融合蛋白基因的表达及产物的分离纯化与活性分析

 为构建表达组织因子 (TF)膜外区的融合载体 ,制备组织因子膜外区 ,抽提人胎盘组织的总RNA,通过 RT- PCR法扩增出 TF的 c DNA克隆至 p UC1 8并测定全序列 .然后以此为模板 ,再次PCR扩增出 TF膜外区 (soluble TF,s TF) c DNA,并将其插入到谷胱甘肽巯基转移酶融合表达载体 p GEX4T- 1 ,构建了 tac启动子控制下的 GST- s TF融合蛋白的表达载体 .表达的融合蛋白经亲和层析、凝血酶切得到纯化的 s TF.表达产物经 ELISA验证 ,能特异性地与 TF抗体结合 .重新脂化后 ,该产物具有较大凝血活性 .以上说明采用融合蛋白表达系统可以大量制备组织因子膜外区 ,为研制国产重组凝血活酶试剂和研究 s TF的结构和功能创造条件 .     

人白细胞介素11的基因克隆及其在大肠杆菌中的表达

从人胚肺二倍体细胞ＫＭＢ１７抽提总ＲＮＡ,经ＲＴ－ＰＣＲ扩增到人ＩＬ－１１ｃＤＮＡ,克隆于ｐＢＳ－ＳＫ,以双脱氧链终止法进行序列分析;扩增去除Ｎ 端第一个氨基酸的ＩＬ－１１ｃＤＮＡ,克隆于硫氧还蛋白融合表达载体ｐＴｈｉｏＨｉｓＡ,经过对表达质粒的改造,使融合表达的ＩＬ－１１能被肠激酶精确切割;表达产物经金属鏊合亲合层析后经肠激酶切,再通过阳离子交换层析纯化后,用其依赖细胞株７ＴＤ１检测活性．结果表明,克隆的ＩＬ－１１ｃＤＮＡ 序列与文献报道一致;表达的融合蛋白占菌体总蛋白的３０％ 左右,以可溶性形式存在;纯化产物具有维持依赖细胞株生长的能力．由此,获得了较高纯度的具有生物学活性的ｒｈＩＬ－１１,为中试生产奠定了基础．     

人白细胞介素1受体拮抗剂cDNA克隆及其表达影响因素

采用ＰＣＲ技术成功地从人胎盘ｃＤＮＡ文库中扩增出人白细胞介素１受体拮抗剂（ｈＩＬ １ｒａ）成熟蛋白编码区基因,并以此为模板突变其ｃＤＮＡ５;其克隆产物经物理图谱证实与文献报道完全一致,利用含不同ＳＤ的同一表达质粒分别表达含不同５的ｃＤＮＡ,结合文献分析其表达影响因素,同时对ｈＩＬ １ｒａＥ．ｃｏｌｉ表达产物的可能存在形式进行了推论。     

Cloning and pharmacological characterization of a human bradykinin (BK-2) receptor.

A human BK-2 bradykinin receptor was cloned from the lung fibroblast cell line CCD-16Lu. The cDNA clone encodes a 364 amino acid protein that has the characteristics of a seven transmembrane domain G-protein coupled receptor. The predicted amino acid sequence of the human BK-2 receptor is 81% identical to the smooth muscle rat BK-2 receptor (1). Transfection of the human BK-2 receptor cDNA into COS-7 cells results in the expression of high levels of specific BK binding sites. Saturation binding analysis indicates that the human BK-2 receptor expressed in COS-7 cells binds BK with a KD of 0.13 nM. Pharmacological characterization of the expressed BK receptor is consistent with the cDNA encoding a receptor of the BK-2 subtype. The BK-2 receptor antagonist Hoe 140 (2), D-Arg0[Hyp3, Thi5, D-Tic7, Oic8]BK has a high affinity (IC50 = 65 pM) for the cloned human receptor. The tissue distribution of the human BK-2 receptor was analyzed by competitive PCR with human tissue cDNA and is similar to that determined for the BK-2 receptor in the rat.     

Hamster estrogen receptor cDNA: cloning and mRNA expression

Estrogen-induced hamster kidney tumor model serves as a useful model to study the biochemical and molecular mechanisms of hormonal carcinogenesis. In this model, we have demonstrated an increased expression of estrogen receptor mRNA and protein in estrogen-treated kidneys and in estrogen-induced tumors. The sequence information for hamster estrogen receptor gene is not known and has been investigated in this study. A hamster uterus cDNA library was constructed and the 5'-region of the hamster estrogen receptor cDNA cloned from this library using polymerase chain reaction (PCR) methodology. Additionally, hamster kidney polyadenylated RNA was reverse transcribed and PCR amplified using primers that were designed based on maximum homology between mouse, rat and human estrogen receptor cDNAs. These PCR amplified fragments were cloned into plasmid vectors and clones with the expected size of the insert subjected to Southern blot analysis using human estrogen receptor cDNA as a probe. The positive clones on Southern blot analysis and the PCR amplified products from these clones were subjected to DNA sequence analysis. Using this strategy, a full length, 1978 bp hamster estrogen receptor cDNA has been cloned which shows 87% homology with human, 90% with rat and 91% with mouse estrogen receptor cDNA. The deduced amino acid shares 88% homology with human, and 93% with rat and mouse estrogen receptors. Hamster estrogen receptor domain C (DNA binding domain) shows a 100% homology with a similar domain from mouse, rat, human, pig, sheep, horse and chicken estrogen receptor (Genebank reference ID: AF 181077).